用于检测KRAS突变的引物和探针制造技术

本发明专利技术提供用于检测KRAS基因突变的引物和探针。本发明专利技术还提供一种使用本发明专利技术的引物和探针检测KRAS基因突变的方法及试剂盒。本发明专利技术提供的引物和探针可以抑制KRAS野生型的扩增及其与探针的结合，从而可以检测到1％以下的KRAS突变。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供用于检测KRAS基因突变的引物和探针。本专利技术还提供一种使用本专利技术的引物和探针检测KRAS基因突变的方法及试剂盒。本专利技术提供的引物和探针可以抑制KRAS野生型的扩增及其与探针的结合，从而可以检测到1％以下的KRAS突变。【专利说明】用于检测KRAS突变的引物和探针
本专利技术属于生物技术及诊断研宄领域，涉及一种用于检测KRAS突变的引物和探 针，及利用该引物和探针检测样品中是否含有KRAS突变的方法和试剂盒。
技术介绍
RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种-H-RAS、KRAS和N-RAS，分别定位在 11、12和1号染色体上。作为原癌基因的RAS基因被激活后就变成有致癌活性的癌基因， RAS基因通过突变而激活。 KRAS是在多种癌症中经历突变的RAS基因之一。KRAS基因可以是正常状态（称 为野生型）或异常状态（突变型）。正常生理情况下，在细胞受到外界刺激后激活生长因子 等信号通路时，野生型的KRAS被活性生长因子等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化，活化后的 KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白，而后KRAS迅速失活。KRAS激活/失活效应 是受控的。突变型KRAS蛋白导致蛋白功能异常，在无生长因子活化信号刺激下仍处于激活 状态，其功能状态不可控，导致肿瘤的持续增殖等。 密码子12和13处的KRAS基因突变参与肿瘤发生，目前已经广泛使用KRAS基因突 变的鉴定作为癌症诊断，例如胰腺、结肠直肠和非小细胞肺癌。但是检测KRAS基因主要有 普通测序法和基于单纯分型探针的PCR，其中普通测序法的灵敏度为10% -30% (突变型/ 野生型Kras)，基于单纯分型探针的PCR灵敏度约为10%，很难检测到10%以下的Kras基 因突变。
技术实现思路
本专利技术针对上述缺点，提供了一种用于检测KRAS基因突变所用的引物和探针，以 达到可以检测到1%以下的KRAS突变的目的。 为实现上述目的，本专利技术采取下述技术方案来实现： -种用于检测KRAS基因突变的引物，包括： -个正向引物，选自 Fl :GTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGA(SEQ ID NO :1)， F2 ：TTATAAGGCC TGCTGAAAAT GACTG(SEQ ID NO ：2), F3 ：GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTA(SEQ ID NO ：3), F4 ：GGAGTTTGTAAATGAAGTACAGTT(SEQ ID NO ：4), F5 ：TAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO ：5) F：6 ：GAAGTACAGTTCATTACGATACAC(SEQ ID NO ：6), F7 ：GTTCATTACGATACACGTCTGC(S EQ ID N 0 ：7)； 和一个反向引物，选自 Rl：CAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCA(SEQ ID NO ：8) R2 ：GAGAAACCTTTATCTGTATCAAAGAAT(SEQ ID NO ：9) R3 ：CGTCAAGGCACTCTTGCCTAC(SEQ ID NO ：10) R4 ：TGTTGGATCATATTCGTCCACAAA(SEQ ID NO ：11) R5 ：AAATGGTCAGAGAAACCTTTATCTG(SEQ ID NO ：12) R6 ：GTCAGAGAAACCTTTATCTGTATC(SEQ ID NO ：13) R7 :CAACTGGAATTTTCATGATTGAATTTTGTAAG(SEQ ID NO :14)。 本专利技术还提供一种用于检测KRAS基因突变的探针，至少包括一个探针， 选自（A)组或（B)组，其中每组探针包括对应12D、13D、12V、12C、12S、12A、12Rt 种突变的探针； (A) 12D：01 AGTTGGAGCTGATGGC (SEQ ID NO ：15) 或02TTGGAGCTGATGGC(SEQ ID NO :16)， 13D ：01 TAGCTGGTGACGTA(SEQ ID NO ：17) 或02CTGGTGACGTAGGC(SEQ ID NO :18)， 12V ：01 GTTGGAGCTGTTGGC(SEQ ID NO ：19) 或02TTGGAGCTGTTGGC(SEQ ID NO :20)， 12C：01 TTGGAGCTTGTGGCG(SEQ ID NO ：21) 或02TTGGAGCTTGTGGC(SEQ ID NO :22)， 12S：01 AGTTGGAGCTAGTGGC (SEQ ID NO ：23) 或02TTGGAGCTAGTGGC(SEQ ID NO :24)， 12A：01 TGGAGCTGCTGGC (SEQ ID NO ：25) 或02TGGAGCTGCTGGCG(SEQ ID NO :26)， 12R：01 GTTGGAGCTCGTGGC (SEQ ID NO ：27) 或02TTGGAGCTCGTGGC(SEQ ID NO :28)， ⑶ 12D 探针序列为 CCTACGCCATCAGCTCCAA(SEQ ID NO :29)， 13D 探针序列为 CCTACGTCACCAGCTCCAA(SEQ ID NO :30)， 12V 探针序列为 CCTACGCCAACAGCTCCAA(SEQ ID NO :31)， 12R 探针序列为 CCTACGCCACGAGCTCCAA(S EQ ID N 0 :32)， 12C 探针序列为 CCTACGCCACAAGCTCCAA(SEQ ID NO :33)， 12A 探针序列为 CCTACGCCAGCAGCTCCAA(SEQ ID NO :34)， 12S 探针序列为 CCTACGCCACTAGCTCCAA(SEQ ID NO :35); 进一步，所述（A)组或（B)组探针的 5'端设有 Fam，Vic，he X，RoX，Texas red， Cy3, Cy5中的一种焚光物质，优选的，为Fam。 优选的，所述（A)组探针的3'端设有MGBNFQ，对富含A/T模板区分更理想。 优选的，所述（B)组探针的:V端设有BHQl。 本专利技术还提供一种KRAS基因突变的检测方法，使用以下各项进行PCR反应， 任意一个前述正向引物； 任意一个前述反向引物； 至少一个前述的探针，选择前述A组或B组探针中； -个 blocker PNA，选自 PNAOl :GGAGCTGGTGGCGTA G(SEQ ID NO :36)， 或 PNA02 :GGAGCTGGTGGCGT(SEQ ID NO :37)。 优选的，使用一组探针，选自（A)组或（B)组，由于每组探针包括对应12D、13D、 12V、12C、12S、12A、12R七种突变的探针，因此可以检测待测样品中是否含有任意一种密码 子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测KRAS基因突变的引物，包括一个正向引物，选自GTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGA(SEQ ID NO：1)，TTATAAGGCC TGCTGAAAAT GACTG(SEQ ID NO：2)，GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTA(SEQ ID NO：3)，GGAGTTTGTAAATGAAGTACAGTT(SEQ ID NO：4)，TAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO：5)GAAGTACAGTTCATTACGATACAC(SEQ ID NO：6)，GTTCATTACGATACACGTCTGC(SEQ ID NO：7)；和一个反向引物，选自CAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCA(SEQ ID NO：8)GAGAAACCTTTATCTGTATCAAAGAAT(SEQ ID NO：9)CGTCAAGGCACTCTTGCCTAC(SEQ ID NO：10)TGTTGGATCATATTCGTCCACAAA(SEQ ID NO：11)AAATGGTCAGAGAAACCTTTATCTG(SEQ ID NO：12)GTCAGAGAAACCTTTATCTGTATC(SEQ ID NO：13)CAACTGGAATTTTCATGATTGAATTTTGTAAG(SEQ ID NO：14)。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕宁，陈一友，
申请(专利权)人：浙江诺辉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33