本发明专利技术公开了一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。本发明专利技术的试剂盒检测灵敏度高、特异性好，可以实现龟甲胶中龟、牛源性成分的快速检测。本发明专利技术的检测方法能够快速的检测到龟甲胶及其制品中龟、牛源性，从而辨别真伪，具有重复性好、特异性强、准确度高、通量大、使用方便、耗时短的特点。
【技术实现步骤摘要】
一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用
本专利技术涉及一种检测方法，具体涉及一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。属于胶类中药动物源性检测
技术介绍
龟甲胶为龟科动物乌龟的背甲及腹甲，经水煎熬、浓缩制成的固体胶。味咸、甘，微寒，归肝、肾和心经，具有滋阴潜阳，益肾强骨，养血补心之功效，主要用于阴虚潮湿，骨蒸盗汗，头晕目眩，虚风内动，筋骨痿软，心虚健忘等。长期服用龟甲胶利于增强机体自身调节，延年益寿，利于阴虚阳亢患者的身体恢复。随着生活水平的不断提高，龟甲胶成为人们进补的首选之一。据2015年版《中国药典》记载，龟甲胶为龟甲经水煎熬、浓缩制成的固体胶。由于龟甲属于名贵药材，加上近年来对各种龟类动物的严重捕杀，致使龟甲原料的供应有限，随着胶类市场的不断发展，熬胶原料紧缺和原料价格的上涨，部分生产商制作原料用其他动物的杂皮包括猪皮、牛皮等、碎骨代替龟骨，以次充好。这些假冒伪劣产品无论是在外观、色泽和气味上都与正品龟甲胶无明显差别，肉眼很难辨别真假。若消费者长期服用这些伪劣产品，不仅没有任何的治疗效果，服用时间久了还有可能对身体造成伤害。劣质龟甲胶产品的出现影响了整个龟甲胶产业链的健康发展。这就要求发展更加可信、灵敏的检测技术来满足监管部门的质量控制与监管要求。随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为了食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能，由于荧光定量PCR检测整个检测过程为闭管操作，所以有效的减少了实验过程中的污染的风险，目前广泛应用于各个领域。目前，龟甲胶中以DNA为基础的溯源鉴定工作在不断展开。专利CN103630646A通过质谱法快速鉴别龟甲胶中龟源性成分，专利授权号（CN103630634A）通过加入限制性内切酶后利用质谱法快速鉴别龟甲胶中是否含有驴、马、牛、猪或羊源性成分。但这些方法均针对龟甲胶中多肽差异性进行鉴定，而由于技术的局限性，灵敏度和假阳性比率相对较高，判定上不够准确。因此，传统的鉴别方法不能满足当前龟甲胶真伪鉴别的要求。而利用实时荧光定量PCR检测龟甲胶中龟、牛源性的研究目前在国内还尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法与应用。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物，包括两对引物，其核苷酸序列如下：（1）龟特异性引物：正向引物F1序列：5’-CTGGGGTAGCTTGGTTCGTT-3’，如SEQIDNO.1所示；反向引物R1序列：5’-GCCTACGGGCCCATATCAAA-3’，如SEQIDNO.2所示；（2）牛特异性引物：正向引物F2序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’，如SEQIDNO.3所示；反向引物R2序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’，如SEQIDNO.4所示。一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测探针，包括：龟特异性探针P1序列：5’-TTTTGCCGGAAGCACTTTGG-3’，如SEQIDNO.5所示；牛特异性探针P2序列：5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-3’，如SEQIDNO.6所示。作为优选的技术方案之一，龟特异性探针序列和牛特异性探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。作为优选的技术方案之一，龟特异性探针P1序列为：5’-FAM-TTTTGCCGGAAGCACTTTGG-BHQ13’，如SEQIDNO.5所示；牛特异探针P2序列为：5’-JOE-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-BHQ23’，如SEQIDNO.6所示。一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，包括上述荧光PCR检测引物、探针，以及龟甲胶DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。作为优选的技术方案之一，所述PCR检测试剂盒还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：（1）质控体系引物：上游引物F：5’-CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA-3’，如SEQIDNO.7所示；下游引物R：5’-CTTTTACTTCTTTTAATCTTTCCGA-3’，如SEQIDNO.8所示；（2）质控体系探针CntP：5’-TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-3’，如SEQIDNO.9所示；（3）质控体系Isqc序列：CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCGGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如SEQIDNO.10所示。作为进一步优选的技术方案之一，质控体系探针CntP的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。作为优选的技术方案之一，所述PCR检测试剂盒还包括龟和牛阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。作为优选的技术方案之一，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系包括：2×qPCRMasterMix10μL，引物对10μM取1μL，探针用量P1（龟）和P2（牛）终浓度各0.25μM，DNA用量1～50ng/μL取2μL，用双蒸水补足20μL。上述引物、探针或试剂盒在鉴别龟甲胶中龟和牛源性成分中的应用。一种龟甲胶中龟、牛源性多重实时荧光定量PCR检测（MultiplexQuantitativeReal-timePCR）方法，包括以下步骤：（1）提取待测样品DNA，选择靶基因，并进行引物设计和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的构建；（2）使用上述试剂盒进行PCR扩增；（3）设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定龟甲胶中是否含有龟和牛源性成分。作为优选的技术方案之一，步骤（1）中DNA的提取按照专利CN201410317118.7中阿胶DNA提取技术进行提取。作为优选的技术方案之一，步骤（1）中靶基因选自线粒体16SrDNA基因，因为相比基因组而言，线粒体在组织中拷贝数高，而且龟甲胶经过深度加工后破坏程度相对小。作为优选的技术方案之一，步骤（1）中，阳性内标DNA的重组质粒的构建方法如下：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物，包括两对引物，其特征在于，其核苷酸序列如下：（1）龟特异性引物：正向引物F1序列：5’‑CTGGGGTAGCTTGGTTCGTT‑3’，如SEQ ID NO.1所示；反向引物R1序列：5’‑GCCTACGGGCCCATATCAAA‑3’，如SEQ ID NO.2所示；（2）牛特异性引物：正向引物F2序列：5’‑CTGATGGTGCAACCGCTATC‑3’，如SEQ ID NO.3所示；反向引物R2序列：5’‑TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT‑3’，如SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测引物，包括两对引物，其特征在于，其核苷酸序列如下：（1）龟特异性引物：正向引物F1序列：5’-CTGGGGTAGCTTGGTTCGTT-3’，如SEQIDNO.1所示；反向引物R1序列：5’-GCCTACGGGCCCATATCAAA-3’，如SEQIDNO.2所示；（2）牛特异性引物：正向引物F2序列：5’-CTGATGGTGCAACCGCTATC-3’，如SEQIDNO.3所示；反向引物R2序列：5’-TCTAGGGCAGGGTTTTGTGTT-3’，如SEQIDNO.4所示。2.一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测探针，其特征在于，包括：龟特异性探针P1序列：5’-TTTTGCCGGAAGCACTTTGG-3’，如SEQIDNO.5所示；牛特异性探针P2序列：5’-CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-3’，如SEQIDNO.6所示。3.根据权利要求2所述的一种龟甲胶中龟、牛源性荧光PCR检测探针，其特征在于，龟特异性探针序列和牛特异性探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。4.一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光PCR检测引物、权利要求2或3所述的探针，以及龟甲胶DNA提取液和多重实时荧光PCR反应扩增体系。5.根据权利要求4所述的一种龟甲胶中龟、牛源性PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：（1）质控体系引物：上游引物F：5’-CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA-3’，如SEQIDNO.7所示；下游引物R：5’-CTT...
【专利技术属性】
技术研发人员：步迅，刘艳艳，范阳阳，胡悦，张全芳，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东,37
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