用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法技术

一种用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法，包括芯片载体，该芯片载体上固载有经化学修饰的用于检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的核苷酸探针；包括待测样品DNA提取、样品PCR扩增、PCR产物与芯片杂交、芯片杂交后的处理、杂交芯片的扫描及结果判读的步骤。优点是：针对每种弧菌变异区序列设计的特异性探针，显著提高了检测的特异性。本发明专利技术提高了鉴定参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群的能力，同时极大地缩短了检测时间。

【技术实现步骤摘要】
用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法
本专利技术属于微生物检测领域，特别涉及用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片和使用方法。
技术介绍
随着人工养殖迅速发展，养殖水域生态变化，弧菌病已经成为海水养殖动物主要的细菌性病害之一。在世界各地养殖参虾贝水产动物中，由弧菌属(Vibrio)细菌引起的弧菌病(Vibriosis)是普遍流行且危害最大的细菌性疾病，给水产养殖业造成了严重的经济损失。研究表明，弧菌属中的副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌和灿烂弧菌在弧菌种群中占优势，广泛存在于自然海水中，导致弧菌病发生，且具有流行广、发病率高、危害大、死亡率高等特点，给参虾贝等海水动物的养殖造成了巨大的影响。因此，急需一种检测速度快、准确性高、特异性强的参虾贝养殖区致病弧菌的检测方法。目前，海洋微生物检测方法一般为生化检测法，但该方法存在培养周期长，操作繁琐，特异性差等缺点。同时，由于自然环境中仅有小于1％左右的微生物为可培养，而基因芯片不需要活的细菌，只需有DNA即可。现有基因芯片设计的探针多是针对16SrRNA基因，而16SrDNA用于致病弧菌的检测比较保守，由于信息位点较少，因此构建的系统稳定性较差，用于鉴定亲缘关系较接近的细菌，容易产生偏差，引起假阳性，影响检测结果的准确性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可并行性的快速、高效、准确的检测参虾贝养殖区环境及生物体六种致病弧菌群的基因芯片和使用方法。本专利技术的技术方案是：一种用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片，包括芯片载体，其特殊之处在于：所述的芯片载体上固载有经化学修饰的用于检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的核苷酸探针，所述的用于检测副溶血弧菌的探针使用thermostabledirecthemolysin和multidrugresistanceprotein为靶基因、所述的用于检测溶藻弧菌的探针使用23rDNA为靶基因、所述的用于检测鳗弧菌的探针使用methyl-acceptingchemotaxisprotein为靶基因、所述的用于检测哈维氏弧菌的探针使用glycolipidtransferprotein为靶基因、所述的用于检测创伤弧菌的探针使用methyl-acceptingchemotaxisprotein为靶基因、所述的用于检测灿烂弧菌的探针使用putativepermeasesofthedrug/metabolitetransporter为靶基因。各探针的基因序列如下：进一步的，所述化学修饰为氨基修饰。一种用于检测参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群基因芯片的使用方法，包括待测样品DNA提取步骤；样品PCR扩增步骤；PCR产物与芯片杂交步骤；芯片杂交后的处理步骤；杂交芯片的扫描及结果判读的步骤，其特殊之处在于：所述的样品PCR扩增步骤中针对致病弧菌群不同菌种靶基因所设计的PCR扩增的引物序列如下：所述的样品PCR扩增步骤中扩增体系为：PCRMix12.5μL；上游引物(20μmol/L)0.2μL；下游引物(20μmol/L)1μL；模板DNA1μL；ddH2O10.3μL；扩增程序为：①95℃5min；②95℃30s；③61℃或55℃30s；④72℃45s，返回到②35个循环；⑤72℃10min；⑥4℃保存。进一步的，扩增程序③中，DJ1、DJ2、DJ6、DJ11退火温度为61℃；DJ7、D8、DJ13、DJ17退火温度为55℃。本专利技术的有益效果：通过副溶血弧菌使用thermostabledirecthemolysin和multidrugresistanceprotein为靶基因、溶藻弧菌使用23rDNA为靶基因、鳗弧菌使用methyl-acceptingchemotaxisprotein为靶基因、哈维氏弧菌使用glycolipidtransferprotein为靶基因、创伤弧菌使用methyl-acceptingchemotaxisprotein为靶基因、灿烂弧菌使用putativepermeasesofthedrug/metabolitetransporter为靶基因，设计针对副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的特异性探针，进行氨基修饰后，制作可用于快速检测参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群的基因芯片，采用多重PCR技术同时扩增6种致病弧菌靶基因，在基因芯片上平行、快速地鉴定致病弧菌群。所设计的基因芯片能并行性的快速高效检测参虾贝养殖区环境及生物体6种致病弧菌，并且具有更加特异性和敏感性的特点。此外，针对每种弧菌变异区序列设计的特异性探针，显著提高了检测的特异性。本专利技术提高了鉴定参虾贝养殖区环境及生物体致病弧菌群的能力，同时极大地缩短了检测时间。附图说明图1为副溶血弧菌VP2和VP3特异性探针基因芯片验证结果图；图2为溶藻弧菌VA2特异性探针基因芯片验证结果图；图3为鳗弧菌LA3和LA4特异性探针基因芯片验证结果图；图4为哈维氏弧菌VH1和VH2特异性探针基因芯片验证结果图；图5为创伤弧菌VV7特异性探针基因芯片验证结果图；图6为灿烂弧菌VS3和VS6特异性探针基因芯片验证结果图；图7为副溶血弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图8为溶藻弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图9为鳗弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图10为哈维氏弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图11为创伤弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图12为灿烂弧菌模式菌株基因芯片的检测结果；图13为副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌混合模版基因芯片检测结果图；图14为溶藻弧菌环境菌株基因芯片检测结果图；图15为未知病原菌XZBYJ01基因芯片检测结果图；图16为未知病原菌XZBYJ02基因芯片检测结果图。具体实施方式实施例1探针的设计及合成1、目标检测菌种及靶基因本专利技术选择参虾贝养殖区环境及生物体中重要的常见致病弧菌群作为检测对象，包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌。副溶血弧菌使用thermostabledirecthemolysin和multidrugresistanceprotein为靶基因、溶藻弧菌使用23rDNA为靶基因、鳗弧菌使用methyl-acceptingchemotaxisprotein为靶基因、哈维氏弧菌使用glycolipidtransferprotein为靶基因、创伤弧菌使用methyl-acceptingchemotaxisprotein为靶基因、灿烂弧菌使用putativepermeasesofthedrug/metabolitetransporter为靶基因。2、探针设计本专利技术采用18-30bp的寡核苷酸探针。探针参数基本要求是特异性和高效性的杂交，应满足以下条件：①探针Tm值保持相近，在上下10℃范围内浮动；②形成二聚体和发夹结构的连续互补碱基数少于4个；③探针与非目标基因序列的连续匹配碱基数少于7个碱基；④探针与目标基因的错配碱基数少于4个碱基。本专利技术针对不同菌种靶基因共设计10条探针，如表1所示：表1探针信息表3、探针合成将表1的探针在5’端加上15个T的间隔臂，以减少DNA杂交时的空间位阻，提高杂交效率本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片，包括芯片载体，其特征是：所述的芯片载体上固载有经化学修饰的用于检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的核苷酸探针，所述的用于检测副溶血弧菌的探针使用thermostable direct hemolysin和multidrug resistance protein为靶基因、所述的用于检测溶藻弧菌的探针使用23rDNA为靶基因、所述的用于检测鳗弧菌的探针使用methyl‑accepting chemotaxis protein为靶基因、所述的用于检测哈维氏弧菌的探针使用glycolipid transfer protein为靶基因、所述的用于检测创伤弧菌的探针使用methyl‑accepting chemotaxis protein为靶基因、所述的用于检测灿烂弧菌的探针使用putative permeases of the drug/metabolite transporter为靶基因，各探针的基因序列如下：

【技术特征摘要】
1.一种用于检测参虾贝养殖区致病弧菌群的基因芯片，包括芯片载体，其特征是：所述的芯片载体上固载有经化学修饰的用于检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌的核苷酸探针，所述的用于检测副溶血弧菌的探针使用thermostabledirecthemolysin和multidrugresistanceprotein为靶基因、所述的用于检测溶藻弧菌的探针使用23rDNA为靶基因、所述的用于检测鳗弧菌的探针使用methyl-acceptingchemotaxisprotein为靶基因、所述的用于检测哈维氏弧菌的探针使用glycolipidtransferprotein为靶基因、所述的用于检测创伤弧菌的探针使用methyl-acceptingchemotaxisprotein为靶基因、所述的用于检测灿烂弧菌的探针使用putativepermeasesofthedrug/metabolitetransporter为靶基因，各探针的基因序列如下：2.根据权力要去1所述的用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁君，王荦，常亚青，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21