一种青霉菌鉴别用分子标记及引物和探针制造技术

本发明专利技术公开了一种青霉菌鉴别用分子标记及引物和探针，所述青霉菌ITS特异性分子标记具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。针对所述分子标记设计特异性检测青霉菌的基因芯片，能在短时间内对青霉菌进行特异性鉴定，提高青霉菌鉴别的准确性和灵敏性，具有快速、准确、成本低的特点。

Molecular marker, primer and probe for identification of Penicillium

The present invention discloses molecular markers and primers and probes for the identification of Penicillium sp., Penicillium ITS specific molecular markers with the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shown. The gene chip of the molecular marker design specific detection of Penicillium, specific identification of Penicillium in a short period of time, improve the identification accuracy and sensitivity of Penicillium, which is fast, accurate and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种青霉菌鉴别用分子标记及引物和探针
本专利技术属于生物鉴别
，涉及一种真菌的鉴别方法，特别是涉及一种用于鉴别青霉菌的ITS特异性分子标记，以及用于所述鉴别方法的专用引物、探针和基因芯片。
技术介绍
青霉菌，Penicillium(P.species)，是子囊菌亚门、不整囊菌纲、散囊菌目、散囊菌科青霉属真菌的总称。青霉菌菌丝体由多数具有横隔的菌丝组成，通常以产生分生孢子进行繁殖，分生孢子脱落后，遇适宜的环境萌发成菌丝。青霉菌种类很多，通常生于柑桔类水果上，蔬菜、粮食、肉类、皮革和食物上也常有分布。青霉菌也是食用菌菌种分离、菌种生产和栽培过程中广泛引起污染的一种杂菌，在蘑菇、平菇、香菇、凤尾菇、草菇和金针菇等食用菌的制种和栽培过程中均能侵染危害，是影响食用菌产量和品质的常见病菌。青霉存在于多种有机质上，多为腐生或弱性寄生。培养料中的麦麸、米糠等辅料是青霉菌孳生的条件，致病后产生的新分生孢子可通过人工喷水、气流、昆虫等媒介再次传染。青霉菌侵害菇床和污染培养料后，能抑制食用菌菌丝的生长，使之不能形成子实体，即使形成子实体也会使其变褐腐烂。因此，对食用菌及其栽培环境进行青霉菌的快速检测具有现实意义。对于这种肉眼无法观察的致病菌，如果采用常规的培养方法，至少需要4～5天的检测周期，而且其菌落形态还不易明确辨识。随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的真菌鉴定技术提供了有效手段。基因芯片是一种新型的DNA识别技术，利用芯片的高通量和特异性优势，可以在芯片上对真菌进行有效辨识，以提高检测的准确性。同时，基因芯片检测主要操作步骤依靠仪器设备完成，检测周期只需要6～8小时，不依赖传统检测中人的主观经验，可以在短时间内获得准确的检测鉴别结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种青霉菌特异性ITS分子标记，以建立一种快速、灵敏、特异性好的青霉菌鉴别方法。提供用于所述青霉菌鉴别方法的引物和核酸探针，是本专利技术的另一专利技术目的。本专利技术采用基因克隆技术，并结合基因芯片技术，首先获得了青霉菌ITSDNA片段中一段高度保守且特异性强的核酸序列，以作为特异性鉴别青霉菌的分子标记；进而依据该分子标记设计并合成了一组特异性引物和核酸探针，建立了特异性鉴别青霉菌的方法，并对所建立的方法进行了有效性评估试验。为实现上述专利技术目的，本专利技术所提供的青霉菌ITS特异性分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述ITS特异性分子标记是使用通用引物ITS1/ITS4对从青霉菌中提取的总DNA进行PCR扩增，PCR产物进行毛细管测序，测序结果在NCBI中进行全核酸数据库比对分析，确定出的能够作为基因芯片检测靶序列的特征序列。进而，本专利技术根据上述靶序列，依据引物与探针设计原则，设计了一对具有SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述核苷酸序列的、用于扩增所述ITS特异性分子标记的引物，以及一种具有SEQIDNO.4所述核苷酸序列的、用于检测所述ITS特异性分子标记的核酸探针。更具体地，本专利技术是在引物1的5'端标记有荧光报告基团Hex，并将所述核酸探针进行氨基化处理，即在核酸探针的5'端连接氨基，最终人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探针。引物1：5'Hex-GATCTTTCCTGAGTGAGGGCC-3'。引物2：5'-CTACAGAGCGGGTGACAAAGC-3'。核酸探针：5'NH3-TTTTTTTTTTTTACACGGGTGGGGAGGTTGGACCCAGGA-3'。本专利技术还提供了一种用于检测青霉菌的基因芯片。本专利技术所述的基因芯片采用本领域常规方法制备，并在所述基因芯片上固定有上述核酸探针。所述基因芯片采用的片基优选常规的醛基片基，以与所述氨基化的探针配合。本专利技术也提供了一种用于鉴别青霉菌的试剂盒，在所述试剂盒中至少包含有上述的青霉菌检测用基因芯片或核酸探针，用于扩增本专利技术所述青霉菌ITS特异性分子标记的专用引物和PCR扩增试剂，以及其他必要的相关试剂。最后，本专利技术提供了一种鉴别青霉菌的方法，本专利技术所述方法是利用上述青霉菌ITS特异性分子标记对青霉菌进行鉴定，利用PCR方法获得的青霉菌扩增产物中应包含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。具体地，本专利技术所述鉴别青霉菌的方法包括：a)提取待检测样本的基因组总DNA；b)以所述引物对所述提取的总DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；c)将所述PCR扩增产物与所述核酸探针进行原位杂交，以特异性鉴定出所述待检测样本中是否含有青霉菌。本专利技术在PCR扩增产物与核酸探针原位杂交后，洗去未杂交的PCR扩增产物，对杂交结果进行检测。杂交结果为阳性，则所述待测样本中含有青霉菌；杂交结果为阴性，则所述待测样本中不含有青霉菌。本专利技术优选采用激光共聚焦扫描仪对上述杂交结果进行荧光扫描检测。本专利技术上述方法中，所述基因组总DNA提取、PCR扩增、原位杂交的方法也都是常规的。本专利技术较佳的PCR扩增程序如下：95℃预热5min；36个循环：95℃20s，58℃20s，72℃40s；最后72℃延伸5min。使用本专利技术提供的专用引物和核酸探针对青霉菌和不含青霉菌的食用菌进行鉴定，结果显示，只有青霉菌的PCR扩增产物与本专利技术核酸探针杂交结合并呈现阳性结果(检测位点亮)，其他食用菌或食用菌内生菌的PCR扩增产物与本专利技术核酸探针没有杂交结合(检测位点不亮)，说明本专利技术设计的引物能将青霉菌的特异性基因片段扩增出来，并与青霉菌核酸探针进行有效结合。同时，采用不同的核酸探针与青霉菌的PCR扩增产物进行杂交，也只有本专利技术的核酸探针具有阳性响应，其他核酸探针无响应，说明本专利技术青霉菌核酸探针的特异性较好。以上结果证明本专利技术提供的检测方法特异性、准确性好。因此，本专利技术提供的青霉菌ITS特异分子标记以及专用引物和核酸探针能够应用于内生真菌青霉菌的快速鉴定检测。本专利技术的特异性分子标记鉴别方法不仅具有比常规形态学判断更精确的鉴定结果，而且与其他检测方法比较检测时间短、准确性高，检测所需时间只需8个小时，而传统的培养联合化学显色反应鉴定耗时10～15天，拮抗试验则至少需要两周时间。附图说明图1是本专利技术核酸探针对不同真菌的鉴定结果。图中：Cl为亚历山大杯伞检测位点，Hy为烟色垂膜菇检测位点，Le为木瑚菌属Lentariapatouillardii检测位点，Tr为鳞盖口蘑检测位点，Me为条柄铦囊蘑检测位点，Ly为荷叶离褶伞检测位点，Pe为青霉菌检测位点，Cy为柱孢菌检测位点。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步的说明，但应该理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。本领域技术人员在本专利技术基础上对本专利技术作出的各种改动或修改，均应同样落于本专利技术的保护范围之内。下述实施例所用方法如无特殊说明，均按照常规方法和条件进行，或按照商品说明书选择。所用引物、核酸探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。实施例1：青霉菌基因组DNA提取。取500μl过夜培养的青霉素菌液(OD280值0.6)，置于-80℃冷冻30min使充分凝固；将凝固的菌块放于研磨中，液氮环境下充分研磨至粉末状，转移至500μl的CTAB中，65℃水浴约30min；冷却后加入600本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青霉菌ITS特异性分子标记，所述ITS特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种青霉菌ITS特异性分子标记，所述ITS特异性分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一对用于扩增权利要求1所述青霉菌ITS特异性分子标记的引物，具有SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所述的核苷酸序列。3.一种用于检测权利要求1所述青霉菌ITS特异性分子标记的核酸探针，具有SEQIDNO.4所述的核苷酸序列。4.一种用于检测青霉菌的基因芯片，在所述基因芯片上固定有权利要求3所述的核酸探针。5.一种用于鉴别青霉菌的试剂盒，其中包含有权利要求3所述的核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：周林，郭尚，王华，
申请(专利权)人：山西省农业科学院食用菌研究所，
类型：发明
国别省市：山西,14