一种人MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测引物、探针、试剂盒及方法，属于体外核酸检测技术领域。本发明专利技术设计了MTHFR最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，以及MTRR常见的突变位点为66A>G等三个基因多态性位点进行定性检测以及包括内参基因beta globin在内的特异性引物和探针。试剂盒包括检测引物探针组合、对照品、PCR反应液等。通过3个独立的多重PCR反应分别对MTHFR677C>T、MTHFR1298A>C、MTRR66A>G等3个基因多态性位点进行定性检测。本发明专利技术特异性强、灵敏度高、简便快速，便于大规模推广应用。

Human MTHFR and MTRR gene polymorphism detection primer, probe, kit and method

The invention discloses a detection primer, a probe, a kit and a method for the polymorphism of human MTHFR and MTRR gene, which belongs to the technical field of nucleic acid detection in vitro. The invention designs the most common MTHFR two single nucleotide polymorphism 677C> T and 1298A> C and MTRR common mutations of 66A> G three gene polymorphisms were detected, including beta gene globin, specific primers and probe. The kit comprises a primer probe combination, a reference substance, a PCR reaction liquid, etc.. The MTHFR677C>, MTHFR1298A>, C, MTRR66A>, G and other 3 polymorphic loci were detected by 3 independent multiplex PCR reactions, respectively, and the results were analyzed by T. The invention has the advantages of strong specificity, high sensitivity, simple and rapid, and is convenient for large-scale popularization and application.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于体外核酸检测
，具体为一种人MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
叶酸(folicacid)属于B族维生素，是细胞生长繁殖的必需物质，参与机体的很多重要代谢反应。一旦机体发生叶酸缺陷或者是叶酸代谢酶的缺陷，就会导致细胞周期不正常，DNA、蛋白质甲基化反应异常，DNA碱基无法正常合成等多种生化反应异常，从而直接或者是间接导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人心血管疾病的发生。目前，经证实与叶酸代谢密切相关的基因有5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢中的关键酶，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)的主要作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原成活性状态，维持甲基传递通路继续进行，使得体内的同型半胱氨酸维持在无毒水平。MTHFR和MTRR基因位点突变都会引起相应的酶的活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸，引起新生儿出生缺陷和自发性流产等。MTHFR最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，在中国的发生率约为45.2％和18.6％。MTRR常见的突变位点为66A>G，中国人群的发生率为25.7％。通过对叶酸代谢相关的MTHFR和MTRR的基因位点进行检测，可以判断个人叶酸代谢能力的高低，可以辅助临床医生对孕妇产期新生儿神经管缺陷以及心血管疾病发病风险进行评估，指导叶酸个体化的使用。目前针对基因多态性的检测方法有很多，如测序法，基因芯片法，高分辨率溶解曲线法等。测序法虽然是基因多态性的检测的金标准，但是操作繁琐，工作量大，且仪器昂贵，不利于推广。基因芯片法技术仪器要求较高，成本昂贵，不利于大规模推广。高分辨率溶解曲线法受仪器温度控制，假阳性高。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测引物、探针和方法，该方法具有快速、简便、高灵敏度，高特异性，操作简单、检测结果可靠等优点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测引物，所述引物为针对MTHFR677检测的特异性引物SEQIDNO.6和SEQIDNO.7、针对MTHFR1298检测的特异性引物SEQIDNO.10和SEQIDNO.11、针对MTRR66检测的特异性引物SEQIDNO.14和SEQIDNO.15、针对内参基因betaglobin检测的特异性引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，以及PCR反应的公用引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。本专利技术还提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测探针，采取了以下技术方案：一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测探针，所述探针为针对MTHFR677C检测的特异性探针SEQIDNO.8和针对MTHFR677T检测的特异性探针SEQIDNO.9、针对MTHFR1298A检测的特异性探针SEQIDNO.12和针对MTHFR1298C检测的特异性探针SEQIDNO.13、针对MTRR66A检测的特异性探针SEQIDNO.16和针对MTRR66G检测的特异性探针SEQIDNO.17、以及针对内参基因betaglobin检测的特异性探针SEQIDNO.5。本专利技术还提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，采取了以下技术方案：一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括针对MTHFR677检测的特异性引物和特异性探针、针对MTHFR1298检测的特异性引物和特异性探针、以及针对MTRR66检测的特异性引物和特异性探针。在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的PCR扩增反应的公用引物、如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的针对内参基因betaglobin检测的特异性引物、以及如SEQIDNO.5所示的针对内参基因betaglobin检测的特异性探针。在其中一些实施例中，所述SEQIDNO.1～5的工作终浓度分别为400nmol/L～800nmol/L、400nmol/L～800nmol/L、20～100nmol/L、20～100nmol/L、80～250nmol/L。在其中一些实施例中，所述特异性引物和特异性探针的工作终浓度分别为20～100nmol/L和80～250nmol/L。本专利技术还提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测方法，采取了以下技术方案：(1)以人细胞基因组DNA为模板，以针对MTHFR677检测的特异性和公用引物及探针、针对MTHFR1298检测的特异性和公用引物及探针、针对MTRR66检测的特异性和公用引物及探针作为引物和探针分别进行多重PCR扩增，每一循环实时采集CY5、FAM和VIC荧光信号；(2)结果判读。在其中一些实施例中，步骤(2)所述DNA浓度为10ng～50ng。在其中一些实施例中，步骤(2)所述多重PCR扩增的反应体系为：2×PCR缓冲液12.5ul、引物探针组合物1.5ul、样本DNA3ul、ddH2O8ul。在其中一些实施例中，步骤(2)所述多重PCR扩增的反应程序均为：95℃10分钟启动后，95℃30秒、66℃40秒共10个循环，然后95℃30秒、59℃30秒共30个循环。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术提供的人MTHFR和MTRR基因多态性的检测引物和探针具有高特异性和高灵敏度；2、本专利技术提供的人MTHFR和MTRR基因多态性的检测方法是针对人MTHFR最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，以及人MTRR常见的突变位点为66A>G等三个基因多态性位点，采用3个多重PCR反应分别进行定性检测，并采用betaglobin作为内参基因，在3个多重PCR反应中均采用HAND引物系统，利用公用引物进行多重PCR反应扩增，即增加多重PCR反应的兼容行，也保证了扩增效率的一致性，减少了扩增效率差异导致的结果偏差；3、本专利技术提供的检测方法采用闭管检测，避免样本交叉污染，检测快速、简便、结果可靠，适用于大规模推广应用。附图说明图1为本专利技术实施例2中MTHFR677C/C纯合图；图2为本专利技术实施例2中MTHFR677C/T杂合图；图3为本专利技术实施例2中MTHFR677T/T纯合图；图4为本专利技术实施例2中MTHFR1298A/A纯合图；图5为本专利技术实施例2中MTHFR1298A/C杂合图；图6为本专利技术实施例2中MTHFR1298C/C纯合图；图7为本专利技术实施例2中MTRR66A/A纯合图；图8为本专利技术实施例2中MTRR66A/G杂合图；图9为本专利技术实施例2中MTRR66G/G纯合图；图10为本专利技术实施例2中MTHFR677C/C纯合图；图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测引物，其特征在于，所述引物为针对MTHFR677检测的特异性引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、针对MTHFR1298检测的特异性引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11、针对MTRR66检测的特异性引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15、针对内参基因beta globin检测的特异性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，以及PCR反应的公用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测引物，其特征在于，所述引物为针对MTHFR677检测的特异性引物SEQIDNO.6和SEQIDNO.7、针对MTHFR1298检测的特异性引物SEQIDNO.10和SEQIDNO.11、针对MTRR66检测的特异性引物SEQIDNO.14和SEQIDNO.15、针对内参基因betaglobin检测的特异性引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，以及PCR反应的公用引物SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。2.一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测探针，其特征在于，所述探针为针对MTHFR677C检测的特异性探针SEQIDNO.8和针对MTHFR677T检测的特异性探针SEQIDNO.9、针对MTHFR1298A检测的特异性探针SEQIDNO.12和针对MTHFR1298C检测的特异性探针SEQIDNO.13、针对MTRR66A检测的特异性探针SEQIDNO.16和针对MTRR66G检测的特异性探针SEQIDNO.17、以及针对内参基因betaglobin检测的特异性探针SEQIDNO.5。3.一种人MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对MTHFR677检测的特异性引物和特异性探针、针对MTHFR1298检测的特异性引物和特异性探针、以及针对MTRR66检测的特异性引物和特异性探针。4.根据权利要求3所述的人MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的PCR扩增反应的公用引物、如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的针对内参基因betaglobin检测的特异性引物、以及如SEQIDNO.5所示的针对内参...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓辉，徐素茹，杨祖婷，
申请(专利权)人：广州市达晖生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44