长链非编码RNA LINC00673原位杂交探针的应用方法技术

本发明专利技术公开了一种长链非编码RNA(LncRNA)LINC00673原位杂交探针的应用方法，即用于制备口腔肿瘤患者的预后制剂，特别是制备出原位杂交检测法预测口腔肿瘤患者预后的试剂盒。通过研究证实LncRNA LINC00673在口腔肿瘤组织中表达上调，高表达LncRNA LINC00673的口腔肿瘤患者比低表达LncRNA LINC00673的口腔肿瘤患者预后差，因此，将LncRNA LINC00673的表达用于口腔肿瘤患者的预后预测，可以为口腔肿瘤患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Application method of long chain non coding RNA LINC00673 in situ hybridization probe

The invention discloses a long chain of non encoding RNA (LncRNA) using LINC00673 in situ hybridization probe, which is used for the preparation of oral cancer patients prognosis preparation, especially the preparation of in situ hybridization detection kit for oral cancer prognosis prediction. The study confirmed the upregulation of the expression of LncRNA LINC00673 in oral tumor tissue, high expression of LncRNA LINC00673 oral tumor patients than oral tumor prognosis in patients with low expression of LncRNA LINC00673 difference, therefore, the expression of LncRNA LINC00673 for predicting the prognosis of oral cancer patients, can provide a molecular basis for the prognosis of oral cancer patients is strong the far-reaching clinical significance and important application prospect.

【技术实现步骤摘要】
长链非编码RNALINC00673原位杂交探针的应用方法
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNALINC00673的原位杂交探针的应用方法。
技术介绍
口腔颌面部恶性肿瘤是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研究表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，其中抑癌基因的失活与癌基因的激活发挥了关键的作用。长链非编码RNAs(longnon-codingRNAs,lncRNAs)是一类长度超过200nt、缺少特异完整的开放阅读框、无或很少有蛋白编码功能的RNAs分子。最近的研究表明，lncRNAs通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，它们参与了生物体生长、发育、衰老及死亡等重要生命活动的调控。越来越多的研究表明lncRNAs的异常表达或功能缺失与肿瘤的发生发展密切相关。一些lncRNAs分子在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要的意义，且可以作为肿瘤预后判断新的分子标记。目前，已经克隆的人类lncRNAs基因已超过4万多个，但绝大部分lncRNA的功能未知。我们检测了LINC00673在临床离体肿瘤样本中的表达水平，并分析了LINC00673表达水平与临床病例资料的相关性。我们从口腔肿瘤及相对应的正常对照组织中抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了LINC00673的表达情况，结果显示LINC00673在口腔肿瘤组织中表达上调。我们随后又利用原位杂交的方法，进一步在存档石蜡样本验证了LINC00673在口腔肿瘤中表达显著上调，因此针对LINC00673的检测制剂可用于口腔肿瘤的辅助诊断，结合临床回访资料进行生存曲线分析发现LINC00673表达高的患者其生存时间短于该lncRNA表达低的患者，因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于口腔肿瘤的预后判断。我们还针对该lncRNA基因的序列设计并合成了用于抑制LINC00673表达的小RNA干扰序列(siRNAs)，利用siRNAs在口腔肿瘤细胞系中抑制了LINC00673的表达，且发现抑制该lncRNA表达可抑制口腔肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。因此针对该lncRNA的抑制制剂也具有口腔肿瘤基因治疗的潜在用途。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供lncRNALINC00673的原位杂交探针的应用方法，利用检测LINC00673的原位杂交探针可以制备用于口腔肿瘤辅助诊断或者预后预测的制剂。本专利技术长链非编码RNALINC00673原位杂交探针的应用方法，用于制备口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂，该长链非编码RNALINC00673的序列见SEQNO:1。原位杂交检测LINC00673表达的探针序列如下：LINC00673探针1：5’-GAAAAACCTCTTGCACCACCTTAGTCTCCAAAGA-3’；LINC00673探针2：5’-CTTTCCTGTTCTTTCTCCTACCCTTCCTGACTAG-3’；LINC00673探针3：5’-CATGAAGTAATAATAAAGGTTCCGCTTATCAACC-3’。一种口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测的试剂盒，含有以下原位杂交检测LINC00673表达探针的一条或几条：LINC00673探针1：5’-GAAAAACCTCTTGCACCACCTTAGTCTCCAAAGA-3’；LINC00673探针2：5’-CTTTCCTGTTCTTTCTCCTACCCTTCCTGACTAG-3’；LINC00673探针3：5’-CATGAAGTAATAATAAAGGTTCCGCTTATCAACC-3’。试剂盒中还含有阳性对照探针：GAPDH探针1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'；GAPDH探针2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'；GAPDH探针3：5’-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3’。试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、DAB染色试剂；其它常规生物化学试剂，包括20x柠檬酸钠缓冲溶液(salinesodiumcitrate,SSC)，硫酸葡聚糖(Dextransulphate)，去离子甲酰胺(DeionizedFormamide)，多聚腺苷酸(polyadenylicacid，PolyA)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylicacid，PolydA)，变性剪切的蛙精DNA(denaturedandshearedsalmonspermDNA，ssDNA)，酵母转运RNA(yeastt-RNA，tRNA)，二硫苏糖醇(DTT)，50x邓罕氏缓冲液(Denhardts’ssolution)，磷酸缓冲液(PBSbuffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白(BSA)，三乙醇胺(TEA)，醋酸酐，TNB缓冲液(即：pH7.5的0.1MTris-Cl+0.15MNaCl+0.5％阻断试剂)，TNT缓冲液(即：pH7.5的0.1MTris-Cl+0.15MNaCl+0.05％Tween20)。我们通过原位杂交在口腔肿瘤及正常口腔上皮存档石蜡组织标本中发现LINC00673在口腔肿瘤中表达显著上调，且LINC00673的表达与预后密切相关，LINC00673表达高的患者更快地死亡，提示LINC00673可作为口腔肿瘤预后预测的分子标志。本专利技术为口腔肿瘤的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。附图说明图1为利用实时荧光定量PCR的方法检测口腔肿瘤离体样本中LINC00673的表达水平；LINC00673在口腔肿瘤(T)中的表达比正常对照(N)样本中显著上调；图2为原位杂交检测LINC00673在口腔肿瘤及正常口腔粘膜中的表达；左图为正常口腔粘膜组织，右图为口腔肿瘤组织(放大倍数：200×)，LINC00673在口腔肿瘤中表达水平较高；图3为口腔肿瘤中LINC00673的表达与患者预后的相关性；LINC00673低表达的患者预后比LINC00673高表达或不表达者好，即LINC00673高表达的患者更快死亡。图4为在口腔癌细胞中导入LINC00673的干扰siRNA序列，可显著抑制LINC00673在口腔癌细胞中的表达；图中si673为导入LINC00673的干扰siRNA序列的口腔癌细胞，NC为阴性对照；在口腔癌细胞系Tca8113中导入靶向LINC00673的siRNA混合物后，实时荧光定量PCR方法检测了口腔癌细胞中LINC00673的表达情况，LINC00673的表达均受到明显的抑制。阴性对照(NC)为Scramble干扰siRNA序列。图5为在口腔癌细胞中导入LINC00673的siRNA抑制LINC00673表达后，细胞迁移能力降低；图中si673为导入LINC00673的干扰siRNA序列的口腔癌细胞，NC为阴性对照；细胞划痕实验证实，在口腔癌细胞系Tca8113中转入靶向LINC00673的siRNA，抑制LINC00673的表达后，划痕愈合速度减慢，表明细胞向划痕中央迁移的能力降低。图6为在口腔癌细胞中导入LINC00本文档来自技高网...

【技术保护点】
长链非编码RNA LINC00673原位杂交探针的应用方法，其特征在于，用于制备口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂，该长链非编码RNA LINC00673的序列见SEQ NO:1。

【技术特征摘要】
1.长链非编码RNALINC00673原位杂交探针的应用方法，其特征在于，用于制备口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂，该长链非编码RNALINC00673的序列见SEQNO:1。2.根据权利要求1所述的长链非编码RNALINC00673原位杂交探针的应用方法，其特征在于，原位杂交检测LINC00673表达的探针序列如下：LINC00673探针1：5’-GAAAAACCTCTTGCACCACCTTAGTCTCCAAAGA-3’；LINC00673探针2：5’-CTTTCCTGTTCTTTCTCCTACCCTTCCTGACTAG-3’；LINC00673探针3：5’-CATGAAGTAATAATAAAGGTTCCGCTTATCAACC-3’。3.一种口腔肿瘤辅助诊断或者疗效预测的试剂盒，其特征在于，含有以下原位杂交检测LINC00673表达探针的一条或几条：LINC00673探针1：5’-GAAAAACCTCTTGCACCACCTTAGTCTCCAAAGA-3’；LINC00673探针2：5’-CTTTCCTGTTCTTTCTCCTACCCTTCCTGACTAG-3’；LINC00673探针3：5’-CATGAAGTAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭灿，曾朝阳，熊炜，李桂源，喻建军，刘彦，李小玲，龚朝建，张姗姗，张文玲，马健，彭淑平，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43