一种利用整体原位杂交技术检测环境污染物发育毒性的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种利用整体原位杂交技术检测环境污染物发育毒性的方法。所述方法，包括：采用整体原位杂交技术检测环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。采用本发明专利技术所述方法能够预测环境污染物对斑马鱼器官、组织的潜在毒性作用，进一步揭示环境污染物的作用模式，缩短检测周期，真正实现早期预警的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用整体原位杂交技术检测环境污染物发育毒性的方法。
技术介绍
斑马鱼是一种重要的模式生物，其基因与人类的基因相似度高达87％左右，用斑马鱼为实验材料得到的实验结果对人体具有重大借鉴意义；因此斑马鱼在毒理学研究中应用十分广泛，特别是斑马鱼的胚胎对化学品具有高度的毒性敏感性，能够检测出极低含量的有毒环境污染物的毒理作用。斑马鱼在毒理学中的应用是近几年发展快速。为了鉴定环境污染物的毒性,我们需要分析斑马鱼毒理学终点和污染物剂量的相关性，确定其毒物作用动力学模式，从而阐明其毒理学机制。关于环境污染物对鱼类早期发育影响的研究目前大都处于表型观察阶段，大部分实验主要通过斑马鱼的生长基本参数，比如死亡率、组织损伤程度和心包水肿等来研究其对斑马鱼早期的发育毒性作用。然而，这种方法具有一定的局限性。首先，生物体是一个有机的整体，从接触暴露物到身体做出反应，需要体内各器官共同协调作用，当暴露浓度超过生物体承受的极限后，才会表现出机体的损伤；其次，在日常生活中，人类往往是长期低剂量的接触环境污染物，以身体损伤为终点的暴露实验就需要很高的暴露浓度和较长的暴露时间，这样当把实验结果外推到人体上时，就会有很大的不确定性和不准确性。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种利用整体原位杂交技术检测环境污染物发育毒性的方法。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供了一种检测环境污染物的方法，包括：采用整体原位杂交技术检测环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。进一步地，所述方法包括：根据斑马鱼胚胎囊胚预定命运图(fatemap)，选取斑马鱼囊胚预定命运基因作为生物标志基因，利用整胚原位杂交技术检测环境污染物对所述生物标志基因转录表达量变化的影响，进而检测环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。本专利技术一实施例中，选取斑马鱼囊胚预定命运基因脊索中胚层标记基因ntl作为生物标志基因的代表进行了研究。但是，并不限于该斑马鱼囊胚预定命运基因脊索中胚层标记基因ntl。只要是选取斑马鱼囊胚预定命运关键基因作为生物标志基因均可，如标记血液发育相关基因fech、标记表皮层发育关键基因foxi1、标记脑发育关键标记基因cyp26a1、标记肌肉发育相关关键标记基因myod1和前脊索板(PCP)标记基因ssha等。进一步地，所述方法包括：(1)根据斑马鱼胚胎囊胚预定命运图，选取斑马鱼囊胚预定命运基因作为生物标志基因，并针对所述生物标志基因，提供杂交用反义RNA探针；(2)将斑马鱼胚胎在环境污染物中进行暴露处理，固定与保存；(3)将固定与保存后的斑马鱼胚胎进行整体原位杂交，检测生物标志基因表达量变化，获得环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。优选地，步骤(2)中，进行整体原位杂交包括：原位杂交第一天：复水、清洗、预杂交、反义RNA探针杂交；原位杂交第二天：移出反义RNA探针、清洗、封闭、孵育抗体；原位杂交第三天：移除抗体、清洗、显色、分析生物标志基因表达量变化。优选地，步骤(2)中，反义RNA探针用于结合生物标志基因。优选地，步骤(2)中，抗体用于结合反义RNA探针。进一步地，所述环境污染物选自但不限于纳米银。本专利技术的第二方面，提供了前述方法用于快速检测微量环境污染物的用途。本专利技术的第三方面，提供了前述方法用于研究环境污染物作用模式的用途。本专利技术的第四方面，提供了前述方法用于评价环境安全性的用途。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：斑马鱼早期发育是一个动态过程，其毒性作用的外在表现需要一定的时间。随着胚胎囊胚预定命运图(fatemap)的解析，利用斑马鱼的关键基因表达图式，进行毒性评价的方法可由表型的观察逐渐深入到分子表达图式水平上。利用胚胎囊胚预定命运图(fatemap)，寻找合适的生物标志基因，有助于利用毒性通路的紊乱来评估化学物对人体的损害，识别并鉴定出生物体内有害结局路径(AOP)，确定毒性通路分子起始事件(MIE)，识别环境污染物毒性导致损伤的关键事件，预测环境污染物对斑马鱼器官、组织的潜在毒性作用，进一步揭示环境污染物的作用模式，缩短检测周期，真正实现早期预警的目的。附图说明图1斑马鱼胚胎30％外包期ntl基因纳米银0mg/L对照组，其中，30％外包期是指：外包运动开始时卵黄细胞的隆起，产生所谓的胚层，当胚层边缘达动-植物极距离的30％时，此时称为30％外包期。图2斑马鱼胚胎30％外包期ntl基因纳米银10mg/L暴露组。图3暴露于30mg/L纳米银组的斑马鱼胚胎30％外包期ntl基因表达情况。图4斑马鱼胚胎30％外包期ntl基因纳米银90mg/L暴露组。具体实施方式在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。除非另外说明，本专利技术中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。实施例1本实施例根据胚胎囊胚预定命运图(fatemap)，选取斑马鱼囊胚预定命运基因脊索中胚层标记基因ntl作为生物标志基因，利用整胚原位杂交技术检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测环境污染物的方法，包括：采用整体原位杂交技术检测环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。

【技术特征摘要】
1.一种检测环境污染物的方法，包括：采用整体原位杂交技术检测环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：根据斑马鱼胚胎囊胚预定命运图，选取斑马鱼囊胚预定命运基因作为生物标志基因，利用整胚原位杂交技术检测环境污染物对所述生物标志基因转录表达量变化的影响，进而检测环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物标志基因可选取但不限于斑马鱼囊胚预定命运基因脊索中胚层标记基因ntl。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)根据斑马鱼胚胎囊胚预定命运图，选取斑马鱼囊胚预定命运基因作为生物标志基因，并针对所述生物标志基因，提供杂交用反义RNA探针；(2)将斑马鱼胚胎在环境污染物中进行暴露处理，固定与保存；(3)将固定与保存后的斑马鱼胚胎进...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴得胜，谢少林，陈秋，牛阿萍，
申请(专利权)人：中国科学院重庆绿色智能技术研究院，
类型：发明
国别省市：重庆;50