一种实验动物资源质量快速监测方法技术

本发明专利技术涉及一种实验动物资源质量快速监测方法。揭示一种可特异性鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的方法，筛选获得了特异性非常好的PCR引物，具有检测灵敏度和准确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物学领域，更具体地，本专利技术涉及一种实验动物资源质量快速监测方法。
技术介绍
实验动物资源(胚胎、精子等)冷冻技术的应用有许多优点。在医学生物学研究中，需要各种品系的实验动物，在隔离器内保养动物品系需要花费大量的人力和物力，代价昂贵。如将暂时用不着的动物资源进行冷冻，就可以长期保存，既安全又能节省人力和物力。采用动物资源运输代替活动物运输，既方便又能减少疾病的传播，便于国际间实验动物品系的相互交流。此外，能够保存有价值的遗传物质，建立基因库，防止实验动物的遗传漂变。实验动物资源中若带有的病原微生物，会对生殖细胞等的品质、保存及受胎效果等产生影响，并且可能导致最后获得的实验动物中也带这些病原微生物，最终影响实验动物质量。而病原微生物在实验动物上可以引起动物疫病表现，甚至发生死亡，使动物繁殖率下降和动物发育不良，影响动物自身的稳定性和反应性，甚至引起人兽共患病，严重影响动物实验的正常进行，并对饲养人员和实验人员的健康和安全造成威胁。目前已有共识，实验动物资源(胚胎、精子等)冷冻操作都不是无菌的技术，在动物的运输过程中，资源的冷冻过程中，包括冷冻所需的试剂和实验室的环境中可能都会导致实验动物资源中带有某些日常生活中比较常见的病原微生物。并且实验室所使用的主要冷冻媒介是液氮(-196℃)，液氮中微生物含量非常低，但是，在储存和分配过程中会被病原微生物污染，从而成为冷冻芽孢、酵母菌、细菌和病毒的有效培养基。在实验动物的微生物质量控制中，很多病原微生物必须被排除，但是目前在实验动物资源中对这些病原微生物还没有进行严格检测控制，所以建立一个实验动物资源(胚胎、精子等)质量(微生物)快速监测方法以保证实验动物资源的微生物质量达标。金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性链球菌是实验动物上比较常见的病原微生物，它们广泛存在于空气和水中，是人和动物体表、皮、毛、鼻、口腔、消化道的常见菌，也是条件性致病菌。中华人民共和国国家标准GB14922.2-2011规定金黄色葡萄球菌检测采用分离培养法与生化鉴定相结合的方法。采取可疑样品接种于高盐甘露醇(SP)培养基，置37℃培养18-24h。SP培养基上形成1mm左右、凸起、黄色的菌落，菌落周围的培养基因金黄色葡萄球菌发酵甘露醇而红色变成黄色。挑取单菌落转接于血琼脂平皿，37℃培养18-24h，形成白色或金黄色、凸起、圆形、不透明、表面光滑、周围有β溶血环的群落。革兰氏染色后镜检观察，其为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄球状，无荚膜和芽孢。当符合以上结果时，做血浆凝固酶实验。同时设立已知的血浆凝固酶阳性和阴性的金黄色葡萄球菌及营养肉汤培养基作为对照。但已知的阳性株和待检株均出现凝固块时，可判断待检菌株为金黄色葡萄球菌。中华人民共和国国家标准GB14926.13-2001规定肺炎克雷伯氏菌采用分离培养法与生化鉴定相结合的方法。采取可疑样品接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)培养基，置37℃培养18-24h。DHL培养基上形成淡粉色，大而隆起，光滑湿润，呈粘液状，相邻菌落易融合成浓汁样，直接接种针挑取时刻拉出较长的丝。革兰氏染色后镜检观察，其为革兰氏阴性短杆菌，单个、成双或成短链排列，有荚膜，无芽孢。挑取单菌落转接于碘化钾或三糖铁(TSI)琼脂培养基36±1℃培养18-24h，斜面产酸，底层产酸产气，或仅产酸不产气，硫化氢阴性。VP试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，MR阴性，西蒙氏柠檬酸盐利用实验阳性，丙二酸盐试验阳性，尿素酶阳性，赖氨酸脱羧酶阳性、鸟氨酸脱羧酶阴性，利用葡萄糖和乳糖，靛基质阴性，半固体动力试验阴性。凡符合上市各项检测结果者，可判断待检菌株为肺炎克雷伯氏菌。中华人民共和国国家标准GB14926.13-2001规定乙型溶血性链球菌采用分离培养法与生化鉴定相结合的方法。采取可疑样品接种于血琼脂培养基，置37℃培养18-24h。血琼脂培养基上形成1mm左右，灰白色圆形、凸起，半透明或不透明，表面光滑，周围有2-4mm界限分明，无色透明溶血环(β溶血)的小菌落。革兰氏染色后镜检观察，其为革兰氏阳性球菌，成链状排列。固体培养基上生长多呈短链或葡萄状，而液体培养基中则成典型的链球状排列。链激酶试验阳性，杆菌肽敏感试验阳性。凡符合上市各项检测结果者，可判断待检菌株为乙型溶血性链球菌。多年来，在实验动物病原微生物的检测中主要是依靠传统的分离培养和生化鉴定方法，它是微生物学上普遍认可的经典方法，容易得出明确的结论，实验结果可以反复验证，并可以在绝大多数的实验室开展。但是这些方法或耗时，或特异性低，且需要检测人员对病原微生物的菌落形态、理化反应性质等有准确的判断，才能得出正确的结论，这就要求检测人员必须具有扎实的微生物学理论基础和丰富的病原微生物检测经验。因此，对于实验动物病原微生物的检测技术，还需要加以改进，以提高检测效率，提高检测准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种实验动物资源质量快速监测方法。在本专利技术的第一方面，提供一种特异性鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的方法，所述方法包括：(1)以实验动物资源待测样品的DNA为模板，以目标微生物特异性引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；(2)分析PCR扩增产物，若测得阳性产物，则表明存在目标微生物感染；其中，所述的目标微生物是金黄色葡萄球菌，其PCR引物选自：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的引物，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的引物，SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的引物，SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的引物，或SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的引物；或所述的目标微生物是肺炎克雷伯氏菌，其PCR引物选自：SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的引物，或SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物；或所述的目标微生物是乙型溶血性链球菌，其PCR引物选自：SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物，SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物，SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的引物，SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物，SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物，或SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的引物。在一个优选例中，所述的实验动物资源是冷冻的实验动物资源。在另一优选例中，所述的实验动物资源包括(但不限于)：动物胚胎，精子、卵子。在另一优选例中，步骤(2)中，通过对PCR扩增产物进行电泳，若电泳条带阳性，则表明存在目标微生物感染。在另一优选例中，步骤(2)中，通过对PCR扩增产物进行电泳，若电泳条带阳性，将阳性条带中的DNA进行测序，将测序结果与目标微生物的基因序列进行BLAST比较，从而准确确定PCR扩增产物中是否存在目标微生物。在本专利技术的另一方面，提供一种PCR引物，所述引物是扩增金黄色葡萄球菌的引物，选自：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的引物，S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)以实验动物资源待测样品的DNA为模板，以目标微生物特异性引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；(2)分析PCR扩增产物，若测得阳性产物，则表明存在目标微生物感染；其中，所述的目标微生物是金黄色葡萄球菌，其PCR引物选自：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物，或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物；或所述的目标微生物是肺炎克雷伯氏菌，其PCR引物选自：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物，或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物；或所述的目标微生物是乙型溶血性链球菌，其PCR引物选自：SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物，SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物，SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物，SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物，SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物，或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的引物。...

【技术特征摘要】
1.一种特异性鉴定实验动物资源中目标微生物感染情况的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)以实验动物资源待测样品的DNA为模板，以目标微生物特异性引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；(2)分析PCR扩增产物，若测得阳性产物，则表明存在目标微生物感染；其中，所述的目标微生物是金黄色葡萄球菌，其PCR引物选自：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的引物，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的引物，SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的引物，SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的引物，或SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的引物；或所述的目标微生物是肺炎克雷伯氏菌，其PCR引物选自：SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的引物，或SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物；或所述的目标微生物是乙型溶血性链球菌，其PCR引物选自：SEQIDNO:19和SEQIDNO:20的引物，SEQIDNO:21和SEQIDNO:22的引物，SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的引物，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的引物，SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物，SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物，或SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的引物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的实验动物资源是冷冻的实验动物资源。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的实验动物资源包括：动物胚胎，精子、卵子。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，通过对PCR扩增产物进行电泳，若电泳条带阳性，则表明存在目标微生物感染。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，通过对PCR扩增
\t产物进行电泳，若电泳条带阳性，将阳性条带中的DNA进行测序，将测序结果与目标微生物的基因序列进行BLAST比较，从而准确确定PCR扩增产物中是否存在目标微生物。6.一种PCR引物，其特征在于，所述引物是扩增金黄色葡萄球菌的引物，选自：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的引物，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的引物，SEQIDNO:9和SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：强苏静，刘丽均，顾剑洁，赵立虎，徐平，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，上海斯莱克实验动物有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海;31