用于原位合成探针阵列的探针倒转方法技术

本公开涉及将原位合成阵列中的寡核苷酸探针倒转的方法。这些方法可用于将探针相对于底物的定向从3’‑结合翻转至5’‑结合。这些方法也可用于减少或消除原位合成阵列中的截短探针序列的存在。

【技术实现步骤摘要】
交叉引用本申请要求2015年8月18日提交的美国临时申请第62/206,741号和2016年2月9日提交的美国临时申请第62/293,203号的优先权，这些申请以引用的方式整体并入本文。背景诸如通过光刻法来合成原位合成阵列上的寡核苷酸探针可产生伴随在完全所需或预定长度下合成的探针序列(“全长”探针)的不完全或截短探针序列的群体。这类截短探针序列的存在可对于阵列性能具有不利影响，尤其在需要对于自由探针末端进行酶寻址的阵列中，诸如聚合酶延伸反应或连接反应。相比之下，固定于珠粒阵列(例如，Illumina)和其他成点阵列上的寡核苷酸探针通常经由胺或合成连接至探针的5’末端的其他官能团来连接至其底物。以这种方式，仅全长序列得以固定，并且截短或与暴露自由3’末端相关联的其他缺陷得以减少或实际上消除。
技术实现思路
可能需要在合成后从原位合成阵列，诸如通过光刻法来制造的阵列上的探针之中选择性地移除截短探针序列。本公开提供完成截短序列的这种选择性去除的方法，同时使探针序列的定向倒转以使得从3’-末端合成的探针序列转化成经由其5’-末端来连接至底物的探针序列。具体地说，本公开包括原位合成阵列的探针倒转方法，其可使用通用接头和可购得结构单元和试剂。这些方法可包括并入用于释放自由3’-OH末端的通用可裂解接头亚磷酰胺，并入具有用于寡核苷酸合成和合成后环化的正交保护、可寻址官能团的支链接头，使用可购得试剂的用于环化步骤的更有效交联化学，和其他改良。尝试对于原位合成阵列进行探针倒转的以前方法涉及大量特殊接头、结构单元和试剂，从而可能使得它用于原位合成阵列的大规模制造是不可行的。本公开的方面提供方法，其包含：提供具有偶合至所述底物的多个分支接头的底物，其中所述底物包含多个羟烷基，其中每个分支接头包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含偶合至第一寡核苷酸的3’末端的第一可裂解接头，并且其中所述第一寡核苷酸的5’末端偶合至第一叠氮化物基团；并且通过使所述第一叠氮化物基团与第二炔反应来环化所述第一寡核苷酸，其中所述第二炔是所述第一炔或邻接炔；其中当所述第二分支还包含加帽部分时，所述环化的效率增加。在本文提供方面的一些实施方案中，所述多个分支接头经由所述多个羟烷基来偶合至所述底物。在本文提供方面的一些实施方案中，所述多个分支接头经由选自由图2A、图2B和图2C所示结构组成的组的第一中间物来偶合至所述底物。在本文提供方面的一些实施方案中，所述第二炔是所述第一炔。在本文提供方面的一些实施方案中，所述第一可裂解接头经由选自由图3A、图3B和图3C所示结构组成的组的第二中间物而变成所述分支接头的一部分。在本文提供方面的一些实施方案中，所述可裂解接头与所述第一炔之间的比率是约5、约4、约3、约2、约1、约0.5、约0.33、约0.25、约0.2或约0.1。如权利要求1所述的方法，所述方法还包含(c)裂解所述第一可裂解接头，从而使所述第一寡核苷酸的所述3’末端与所述第二分支分离。在本文提供方面的一些实施方案中，所述裂解包含使用碱来去保护。在本文提供方面的一些实施方案中，所述所述效率是至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在本文提供方面的一些实施方案中，另一个第二分支包含偶合至第二寡核苷酸的3’末端的第二可裂解接头，其中所述第二寡核苷酸短于所述第一寡核苷酸，并且其中所述裂解将所述第二寡核苷酸从所述底物中释放。在本文提供方面的一些实施方案中，所述裂解将至少90％的所述第二寡核苷酸从所述底物中释放。本公开的另一个方面提供方法，其包括：提供底物；将多个分支接头连接至所述底物，其中所述分支接头包含(i)包含炔的第一分支和(ii)第二分支；将可裂解接头连接至所述第二分支的第一基团；将加帽部分连接至所述第二分支的第二基团；在所述可裂解接头上以3’至5’定向来合成第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括(i)经由所述可裂解接头来偶合至所述第二分支的3’末端和(ii)偶合至叠氮化物基团的5’末端；并且通过使所述叠氮化物基团与所述炔反应来环化所述第一寡核苷酸，从而将所述第一寡核苷酸的所述5’末端偶合至所述第一分支中的一个。在本文提供方面的一些实施方案中，第二分支的所述第一基团与第二分支的所述第二基团的比率在约5:1至约1:5之间。在本文提供方面的一些实施方案中，第二分支的所述第一基团与第二分支的所述第二基团的比率是约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4或约1:5。在本文提供方面的一些实施方案中，第二分支的所述第一基团与第二分支的所述第二基团的比率是约1或更小。在本文提供方面的一些实施方案中，其中所述加帽部分经由加帽亚磷酰胺的中间物来连接。在本文提供方面的一些实施方案中，所述底物包含多个羟烷基。在本文提供方面的一些实施方案中，所述分支接头经由所述多个羟烷基来偶合至所述底物。在本文提供方面的一些实施方案中，所述方法还包含(c)裂解所述可裂解接头，从而使所述第一寡核苷酸的所述3’末端与所述第二分支的所述第一基团分离。在本文提供方面的一些实施方案中，第二寡核苷酸连接至所述第二分支的第三基团，其中所述第二寡核苷酸缺少连至所述第一分支的共价键，其中所述裂解将所述第二寡核苷酸从所述底物中释放。在本文提供方面的一些实施方案中，底物包含受控微孔玻璃。在本文提供方面的一些实施方案中，所述合成包含光刻合成。本公开的另一个方面提供系统，其包含：包含多个羟烷基的底物；和偶合至所述多个羟烷基的多个分支接头，其中每个所述分支接头包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含第一可裂解接头和加帽部分，其中所述第一可裂解接头偶合至第一寡核苷酸的3’末端，并且其中所述第一寡核苷酸的5’末端偶合至第一叠氮化物基团。在本文提供方面的一些实施方案中，所述第一叠氮化物基团与第二炔反应以环化所述第一寡核苷酸，其中所述第二炔是所述第一炔或邻接炔。在本文提供方面的一些实施方案中，所述可裂解接头与所述加帽部分之间的比率是约10、约5、约4、约3、约2、约1、约0.5、约0.33、约0.25、约0.2或约0.1。在本文提供方面的一些实施方案中，所述多个分支接头经由选自由图2A、图2B和图2C所示结构组成的组的第一中间物来偶合至所述底物。在本文提供方面的一些实施方案中，所述第一可裂解接头经由选自由图3A、图3B和图3C所示结构组成的组的第二中间物而变成所述分支接头的一部分。在本文提供方面的一些实施方案中，所述加帽部分是酰基、二烷氧基磷酰基、烷基、烷氧基羰基或二烷基氨基羰基。在本文提供方面的一些实施方案中，所述第一可裂解接头可使用碱，例如，氨、甲基胺、1,2-二氨基乙烷和碳酸钾来裂解。本公开的另一个方面提供方法，其包含：提供具有偶合至所述底物的多个分支接头的底物，其中每个分支接头包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含偶合至第一寡核苷酸的3’末端的可裂解接头，和其中所述第一寡核苷酸的5’末端偶合至叠氮化物基团；使所述叠氮化物基团与第二炔反应以环化所述第一寡核苷酸，所述反应在室温下通过缓冲液中的Cu(I)催化剂来催化，所述第二炔是所述第一炔或邻接炔；并且(c)裂解所述可裂解接头，从而使所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，其包括：(a)提供底物；(b)将多个分支接头连接至所述底物，其中所述分支接头包含(i)包含炔的第一分支和(ii)第二分支；(c)将可裂解接头连接至所述第二分支的第一基团；(d)将加帽部分连接至所述第二分支的第二基团；(e)在所述可裂解接头上以3’至5’定向来合成第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含(i)经由所述可裂解接头来偶合至所述第二分支的3’末端和(ii)偶合至叠氮化物基团的5’末端；并且(f)通过使所述叠氮化物基团与所述炔反应来环化所述第一寡核苷酸，从而将所述第一寡核苷酸的所述5’末端偶合至所述第一分支中的一个。

【技术特征摘要】
2015.08.18 US 62/206,741;2016.02.09 US 62/293,2031.一种方法，其包括：(a)提供底物；(b)将多个分支接头连接至所述底物，其中所述分支接头包含(i)包含炔的第一分支和(ii)第二分支；(c)将可裂解接头连接至所述第二分支的第一基团；(d)将加帽部分连接至所述第二分支的第二基团；(e)在所述可裂解接头上以3’至5’定向来合成第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含(i)经由所述可裂解接头来偶合至所述第二分支的3’末端和(ii)偶合至叠氮化物基团的5’末端；并且(f)通过使所述叠氮化物基团与所述炔反应来环化所述第一寡核苷酸，从而将所述第一寡核苷酸的所述5’末端偶合至所述第一分支中的一个。2.如权利要求1所述的方法，其中第二分支的所述第一基团与第二分支的所述第二基团的比率在约5:1至约1:5之间。3.如权利要求1所述的方法，其中所述底物包含多个羟烷基。4.如权利要求1所述的方法，其还包含(c)裂解所述可裂解接头，从而使所述第一寡核苷酸的所述3’末端与所述第二分支的所述第一基团分离。5.如权利要求4所述的方法，其中第二寡核苷酸连接至所述第二分支的第三基团，其中所述第二寡核苷酸缺少连至所述第一分支的共价键，其中所述裂解将所述第二寡核苷酸从所述底物中释放。6.一种系统，其包括：(a)包含多个羟烷基的底物；和(b)偶合至所述多个羟烷基的多个分支接头，其中每个所述分支接头包含(i)包含第一炔的第一分支和(ii)第二分支，其中所述第二分支包含第一可裂解接头和加帽部分，其中所述第一可裂解接头偶合至第一寡核苷酸的3’末端...

【专利技术属性】
技术研发人员：周巍，格伦·麦克加尔，维贾伊·辛格，
申请(专利权)人：生捷科技控股公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛;KY