骨组织RNA快速提取试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种骨组织RNA快速提取试剂盒，包括至少一个基因组DNA清除柱、至少一个RNA吸附柱以及与基因组DNA清除柱配合使用的裂解液和与RNA吸附柱配合使用的洗脱液。本发明专利技术的有益效果是：试剂盒采用独有的不含苯酚/氯仿配方的裂解液，并添加多种成分去除骨组织蛋白多糖。采用独特的缓冲体系和双硅胶柱纯化系统解决DNA残留问题，能够得到纯度高，完整性好的骨组织RNA。独特基因组DNA清除柱技术可以有效清除基因组DNA（gDNA）残留，得到的RNA不需要DNA酶消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验，单个样品操作一般可在35分钟内完成，避免提取时间过长，RNA 酶污染等原因造成RNA 降解。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及RNA提取，涉及核酸纯化领域，具体地说就是骨组织RNA快速提取试剂盒。
技术介绍
分子生物学的研究主要集中在核酸和蛋白质，绝大部分的分子生物学研究都需要首先得到纯化的核酸，因此核酸纯化是分子生物学的基石之一，全球市场非常庞大，世界各国都在正在不断改进提取纯化方法，以达到更快、更纯的得到核酸。核酸纯化一般分为RNA提取纯化和DNA提取纯化两大类。世界上主流的RNA提取解决方案主要是两种，一种是1987年Chomczynski专利技术的异硫氰酸胍/酸酚/氯仿一步法抽提总RNA(俗称TRIzol法)，这是RNA提取纯化技术的第一个里程碑。其纯化原理为：在异硫氰酸胍/酸酚的条件下，DNA溶解于有机相，RNA溶解于水相，而蛋白质则在中间相；从而有效地将RNA和DNA/蛋白质分开。该方法优点是经济，灵活。缺点是使用苯酚，氯仿毒性物质。另一种是硅胶柱（SpinColumns）纯化技术，这是RNA提取纯化技术的第二个里程碑。硅胶柱将核酸抽提纯化变成一种简单的过滤操作，以取代传统溶液型抽提技术的离心方式。其纯化原理为：硅胶柱的纯化原理就是使用一种特殊的玻璃纤维滤膜，这种滤膜在高离液剂（硫氰酸胍，盐酸胍，NaI等）的条件下，可以同RNA发生吸附反应，同时蛋白质和其它杂质不会被吸附或者漂洗去除，然后在低盐条件下，RNA又可以从滤膜中释放出来，从而达到纯化核酸的目的。该方法的优点是不用苯酚，氯仿毒性物质，操作简单，速度快。缺点是硅胶柱会同时吸附RNA/DNA,因此容易导致DNA残留，造成纯度低。骨组织坚硬、骨组织坚硬、骨细胞密度低、而且外周基质含有大量黏蛋白（蛋白多糖）和RNA难以分离，无法用传统Trizol法进行高质量提取。在提取骨组织RNA的过程中，常由于提取时间过长，RNA酶污染等原因造成RNA降解，使得后续试验无法进行。因此，采用一种快速提取RNA的方法对于进行RNA的相关实验至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速有效提取骨组织RNA的试剂盒，该试剂盒采用独特的缓冲体系和双硅胶柱纯化系统解决DNA残留问题，能够得到纯度高，完整性好的骨组织RNA。本专利技术解决其技术问题所采取的技术方案是：骨组织RNA快速提取试剂盒，包括至少一个基因组DNA清除柱、至少一个RNA吸附柱以及与基因组DNA清除柱配合使用的裂解液和与RNA吸附柱配合使用的洗脱液。作为优化的，所述裂解液包括裂解液RLTPlus和裂解液CLB，所述洗脱液为无核糖核酸酶水。作为优化的，所述裂解液RLTPlus中含有浓度为2-5mol/L的异硫氰酸胍、PH为6.0-8.5的Tris-HCl缓冲溶液、1.5-3.0g/L的十二烷基硫酸钠；所述裂解液CLB中含有浓度为2-5mol/L的异硫氰酸胍、2-2.5g/L的十六烷基三甲基溴化铵、PH为6.0-8.5的Tris-HCl缓冲溶液、2-10g/L的聚乙烯吡咯烷酮、浓度为10-100mmol/L的氯化钠。作为优化的，所述的骨组织RNA快速提取试剂盒还包括漂洗液RW、助提剂PLANTaid、去蛋白液RW1。作为优化的，所述漂洗液RW中含有PH为6.0-8.5、浓度为5-50mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液、浓度为10-100mmol/L氯化钠。作为优化的，所述助提剂PLANTaid中含有0.5-1.0mmol/L的二硫苏糖醇、0.5-2.0%的吐温-20、3-15%的聚乙烯吡咯烷酮。作为优化的，所述去蛋白液RW1中含有2-5mol/L的异硫氰酸胍、体积分数60-80%的乙醇。作为优化的，所述基因组DNA清除柱和RNA吸附柱为硅膜吸附柱。作为优化的，所述的骨组织RNA快速提取试剂盒提取RNA，至少包括如下两个步骤：A步骤，用基因组DNA清除柱将基因组DNA清除；B步骤，用RNA吸附柱将RNA吸附。作为优化的，所述的骨组织RNA快速提取试剂盒提取RNA，包括如下步骤：（1）利用裂解液CLB对样品进行裂解得到裂解物；（2）将裂解物转入离心管，离心，收集上清液，向上清液中加入其体积0.5倍无水乙醇，混匀；（3）A步骤，用基因组DNA清除柱将基因组DNA清除：将上清液加到基因组DNA清除柱上（清除柱放在收集管内），离心弃掉废液，将基因组DNA清除柱置于离心管内，加入裂解液RLTPlus，离心收集滤液；（4）向步骤（3）得到的滤液中加入其体积0.5倍的无水乙醇混匀；（5）B步骤，用RNA吸附柱将RNA吸附：将步骤（4）得到的混合物加入一个RNA吸附柱中，离心，弃掉滤液；（6）向RNA吸附柱中加入去蛋白液RW1，离心，弃掉废液；（7）向RNA吸附柱中加入漂洗液RW，离心，弃掉废液，重复一遍；本专利技术的有益效果是：本试剂盒采用独有的不含苯酚/氯仿配方的裂解液，并添加多种成分去除骨组织蛋白多糖。同时独特基因组DNA清除柱技术可以有效清除基因组DNA（gDNA）残留，得到的RNA不需要DNA酶消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验，单个样品操作一般可在35分钟内完成。附图说明图1、骨组织RNA电泳图。图中从左到右的五个泳道分别为泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5；其中泳道1为分子量标记，泳道2为大鼠股骨头，泳道3为兔椎间盘，泳道4为兔膝关节软骨，泳道5为小鼠胫骨。具体实施方式实验前装备：取1ml裂解液CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入100μlPLANTaid，颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。实验步骤：1.液氮研磨法:a.骨钳夹碎骨组织后放入研钵，加入液氮后反复研磨成细粉，注意液氮蒸发后不断补加保存液氮一直存在。b.转移100mg细粉加至预热的裂解液CLB（已加有PLANTaid）离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。c.立刻接操作步骤的步骤3。2.其它骨组织破碎方法：a.取100mg骨组织加入1ml预热的裂解液CLB（已加有PLANTaid）高速均质仪粉碎匀浆。或者取100mg液氮冷冻包埋切片粉碎的骨头加入裂解液CLB（已加有PLANTaid）粉碎匀浆。b.立刻接操作步骤的步骤3。3.短时放回65°C水浴中（10min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。4.将裂解物13,000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。5.取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。6.将混合物（每次小于720μl，多可以分两次加入）加入一个基因组清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。7.将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不用RNAsefree或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管），在基因组清除柱内加500μl裂解液RLT本文档来自技高网...

【技术保护点】
骨组织RNA快速提取试剂盒，其特征在于：包括至少一个基因组DNA清除柱、至少一个RNA吸附柱以及与基因组DNA清除柱配合使用的裂解液和与RNA吸附柱配合使用的洗脱液。

【技术特征摘要】
1.骨组织RNA快速提取试剂盒，其特征在于：包括至少一个基因组DNA清除柱、至少一个RNA吸附柱以及与基因组DNA清除柱配合使用的裂解液和与RNA吸附柱配合使用的洗脱液。2.根据权利要求1所述的骨组织RNA快速提取试剂盒，其特征在于：所述裂解液包括裂解液RLTPlus和裂解液CLB，所述洗脱液为无核糖核酸酶水。3.根据权利要求2所述的骨组织RNA快速提取试剂盒，其特征在于：所述裂解液RLTPlus中含有浓度为2-5mol/L的异硫氰酸胍、PH为6.0-8.5的Tris-HCl缓冲溶液、1.5-3.0g/L的十二烷基硫酸钠；所述裂解液CLB中含有浓度为2-5mol/L的异硫氰酸胍、2-2.5g/L的十六烷基三甲基溴化铵、PH为6.0-8.5的Tris-HCl缓冲溶液、2-10g/L的聚乙烯吡咯烷酮、浓度为10-100mmol/L的氯化钠。4.根据权利要求1所述的骨组织RNA快速提取试剂盒，其特征在于：还包括漂洗液RW、助提剂PLANTaid、去蛋白液RW1。5.根据权利要求4所述的骨组织RNA快速提取试剂盒，其特征在于：所述漂洗液RW中含有PH为6.0-8.5、浓度为5-50mol/L的Tris-HCl缓冲溶液、浓度为10-100mmol/L氯化钠。6.根据权利要求4所述的骨组织RNA快速提取试剂盒，其特征在于：所述助提剂PLANTaid中含有0.5-1.0mmol/L的二硫苏糖醇、0.5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茂，
申请(专利权)人：山东艾莱普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37