本发明专利技术涉及一种穿山甲甲片的DNA提取方法，其包括以下步骤：1)浸泡穿山甲甲片并进行粉碎；2)取步骤1)所得粉末加入浸泡液于4℃放置过夜，离后弃上清液；3)向步骤2)所得沉淀中加入含有0.1％胶原酶和1％胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h‑120h，充分震荡，离心后弃上清液；4)向步骤3)所得沉淀中加入含有10mmol/L Tris‑HCl、50mmol/L NaCl、2％SDS、1mmol/L DTT、1mmol/L CaCl2和100μl蛋白酶K(10g/L)的消化液，55℃水浴72h，期间每4h震荡混匀一次，离心取上清；5)进行DNA抽提。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种中药DNA的提取方法，具体涉及穿山甲甲片的DNA提取方法。
技术介绍
穿山甲为鲮鲤科动物ManispentadactylaL.的鳞甲，临床主要用于经闭、癥瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、关节痛、麻木拘挛，为妇科常用贵重中药材。近年来，由于大量捕捉和栖息地生态环境的变化，穿山甲数量急剧下降，资源短缺现象严重，穿山甲药材价格逐年攀升，市场上出现了大量的混伪品。常有不法分子以东南亚产马来穿山甲、非洲产大穿山甲及树穿山甲等的甲片混用，甚至用猪、牛、羊等的蹄甲经加工制造伪品，从中牟取暴利，严重影响了药材质量及用药安全。对穿山甲片及混伪品进行准确鉴别是十分必要的。由于穿山甲片与混伪品外观很相似，传统的性状鉴定和显微鉴定难度较大，且需要丰富的经验。理化鉴定目前尚缺乏专属性指标成分。近年来，DNA分子标记技术广泛用于解决中药材鉴定中的难题，如DNA条形码技术等，可对物种进行快速、准确和自动化鉴定。发展穿山甲甲片的DNA分子标记鉴定技术，有望提供一种准确、客观的鉴别穿山甲片及混伪品的鉴别手段。而从甲片药材中获取足量的高质量DNA是对其进行分子标记鉴定的基础。中药材DNA提取是开展中药材DNA分子标记鉴定研究的首要环节。由于商品药材多数经过加工处理，DNA可能会出现不同程度的降解；动物药材中的蛋白质，会影响DNA的提取和PCR的扩增；药材贮存时间的长短，药材的种类不同，如动物药材中的骨甲类与肌肉和分泌类，DNA的提取方法相应有所不同。由于穿山甲甲片高度角质化，提取DNA难度大。邢亚林等人曾报道了一种从穿山甲甲片中提取DNA的方法，但是此提取方法DNA得率低，重复性不好；除此之外，尚无人成功从穿山甲甲片中成功提取出总DNA，特别是从炮山甲中提取DNA的方法尚属空白。本专利技术提出了一种从穿山甲片和炮山甲片中提取基因组DNA的适宜方法，DNA得率高，成功率100％，可用于穿山甲药材的分子鉴定、系统发育研究等工作。
技术实现思路
在我国，穿山甲主要分布于海南、福建、台湾、广东、广西、云南等地，被列为国家Ⅱ级保护野生动物，并被《中国濒危动物红皮书》列为易危级(vulnerable，VU)，列入国际濒临绝种动植物贸易公约附录Ⅱ。近年来，由于大量捕捉和栖息地生态环境的变化，穿山甲数量急剧下降，资源短缺现象严重，穿山甲药材价格逐年攀升，药材市场上不断出现产于东南亚的马来穿山甲(Manisjavanica)甲片、产于非洲的大穿山甲(M.gigantea)和树穿山甲(M.tricuspis)甲片等混淆品，以及猪(Susscrofadomestica)蹄甲、黄牛(Bostaurus)蹄甲、耗牛(B.grunniens)蹄甲、山羊(Caprahircus)蹄甲、绵羊(Ovisaries)蹄甲等伪品，严重影响了药材质量及用药安全。由于穿山甲片与混伪品外观很相似，传统的性状鉴定和显微鉴定难度较大，且需要丰富的经验。理化鉴定目前尚缺乏专属性指标成分。用DNA分子标记技术对穿山甲片及其混伪品进行鉴别，可望为穿山甲片商品药材的鉴定提供新手段。中药材DNA提取是开展中药材DNA分子标记鉴定研究的首要环节。由于商品药材多数经过加工处理，DNA可能会出现不同程度的降解；动物药材中的蛋白质，会影响DNA的提取和PCR的扩增；药材贮存时间的长短，药材的种类不同，如动物药材中的骨甲类与肌肉和分泌类，DNA的提取方法相应有所不同。由于穿山甲甲片高度角质化，提取DNA难度大。邢亚林等人曾报道了一种从穿山甲甲片中提取DNA的方法，但是此提取方法DNA得率低，重复性不好；除此之外，尚无人成功从穿山甲甲片中成功提取出总DNA，特别是从炮山甲中提取DNA的方法尚属空白。因此，有必要设计一种优良的DNA提取方法，能从穿山甲片中提取出足够量的高质量总DNA，用于穿山甲生甲片、炮甲片某些基因片段的扩增和测序及相关的分子鉴定工作。为了解决上述问题，本专利技术提供了一种穿山甲甲片(含炮甲片)的DNA提取方法，其包括以下步骤：1)用无水乙醇浸泡穿山甲甲片10-24h，每隔2-3h更换一次无水乙醇，浸泡期间进行震荡清洗；然后以去离子水浸泡穿山甲甲片10-24h，每隔2-3h更换一次无水乙醇，浸泡期间进行震荡清洗；在60℃下烘干，然后在紫外灯下正反面分别照射灭菌，然后粉碎成细末；2)取步骤1)所得粉末置于离心管中，加入浸泡液(10mmol/LTris-HCl、0.2mol/LEDTA、50mmol/LNaCl、pH8.0)于4℃放置过夜，5000r/min离心10min后弃上清液；3)向步骤2)所得沉淀中加入含有0.1％胶原酶和1％胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h-120h，充分震荡，10000r/min高速离心10min后弃上清液；4)向步骤3)所得沉淀中加入含有10mmol/LTris-HCl、50mmol/LNaCl、2％SDS、1mmol/LDTT、1mmol/LCaCl2和100μl蛋白酶K(10g/L)的消化液，55℃水浴72h-120h，期间每4h震荡混匀一次，10000r/min离心10min取上清；5)以平衡酚以及氯仿：异戊醇(24∶1)混合液进行DNA抽提；6)以无水乙醇进行沉淀；7)以75％冰乙醇进行干燥；8)干燥所得DNA，并以TE溶解DNA。其中，穿山甲甲片为生穿山甲甲片或炮制穿山甲甲片。其中，步骤1)中的粉碎为机械粉碎或以液氮研磨至细粉。其中，步骤5)为：抽提步骤1：加入等体积平衡酚约(700μl)，混匀30min,13000r/min离心10min，取上清液。抽提步骤2：加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)混合液，混匀30min,13000r/min离心10min，取上清液；重复抽提步骤1和抽提步骤2，直至抽提完全。其中，步骤6)为：在上清液中加入两倍体积的冰冻无水乙醇，于-20℃沉淀至少1h，13000r/min离心15min，弃上清液。其中，步骤7)为加入500μl的75％冰乙醇，混匀漂洗以除去残余的盐，13000r/min离心2min，吸去上清液。目前市场上已有DNA提取试剂盒，这种试剂盒比较适合新鲜的植物叶和动物肌肉类DNA的微量提取；由于中药材的特殊性，DNA有大量降解，有时要根据药材本身的特点，如植物药材的根茎，动物药材的骨甲，胆囊等，药材的提取量要有所不同；同时试剂盒的价格也很昂贵，因此实际中并不太适用。虽然穿山甲片中提取DNA的现有技术中已有报道(邢亚林等，2013)，但其重复性不好；而大多数的实验是从穿山甲肌肉组织或甲片内皮中提取出DNA(贾静等，2014)。由于穿山甲甲片材质很硬，角质化程度高，采用普通的DNA提取方法不能提取出DNA，且炮甲片中的DNA比生甲片更难提出，因此需要探索适宜的DNA提取方法，以从穿山甲甲片中高效提取DNA。本专利技术提出一种穿山甲片(含炮甲片)的DNA提取方法，包括样品预处理、消化、提取等步骤。穿山甲甲片为表皮高度角质化形成的角质鳞，角化细胞内富含二硫键的角蛋白不易被破坏，容易导致消化不充分；专利技术人将生甲片的消化时间延长至72h，炮甲片的消化时间延长至120h。DNA提取方法中SDS是一种阴离子去污剂，可溶解细胞膜，裂解细胞，使蛋白质变性、染色体解析，有利于DNA的释放。试剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种穿山甲甲片的DNA提取方法，其包括以下步骤：1)用无水乙醇浸泡穿山甲甲片10‐24h，每隔2‐3h更换一次无水乙醇，浸泡期间进行震荡清洗；然后以去离子水浸泡穿山甲甲片10‐24h，每隔2‐3h更换一次无水乙醇，浸泡期间进行震荡清洗；在60℃下烘干，然后在紫外灯下正反面分别照射灭菌，然后粉碎成细末；2)取步骤1)所得粉末置于离心管中，加入浸泡液(10mmol/L Tris‐HCl、0.2mol/L EDTA、50mmol/L NaCl、pH8.0)于4℃放置过夜，5000r/min离心10min后弃上清液；3)向步骤2)所得沉淀中加入含有0.1％胶原酶和1％胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h‐120h，充分震荡，10000r/min高速离心10min后弃上清液；4)向步骤3)所得沉淀中加入含有10mmol/L Tris‐HCl、50mmol/L NaCl、2％SDS、1mmol/L DTT、1mmol/L CaCl2和100μl蛋白酶K(10g/L)的消化液，55℃水浴72h‐120h，期间每4h震荡混匀一次，10000r/min离心10min取上清；5)以平衡酚以及氯仿：异戊醇(24∶1)混合液进行DNA抽提；6)以无水乙醇进行沉淀；7)以75％冰乙醇进行干燥；8)干燥所得DNA，并以TE溶解DNA。...
【技术特征摘要】
1.一种穿山甲甲片的DNA提取方法，其包括以下步骤：1)用无水乙醇浸泡穿山甲甲片10‐24h，每隔2‐3h更换一次无水乙醇，浸泡期间进行震荡清洗；然后以去离子水浸泡穿山甲甲片10‐24h，每隔2‐3h更换一次无水乙醇，浸泡期间进行震荡清洗；在60℃下烘干，然后在紫外灯下正反面分别照射灭菌，然后粉碎成细末；2)取步骤1)所得粉末置于离心管中，加入浸泡液(10mmol/LTris‐HCl、0.2mol/LEDTA、50mmol/LNaCl、pH8.0)于4℃放置过夜，5000r/min离心10min后弃上清液；3)向步骤2)所得沉淀中加入含有0.1％胶原酶和1％胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h‐120h，充分震荡，10000r/min高速离心10min后弃上清液；4)向步骤3)所得沉淀中加入含有10mmol/LTris‐HCl、50mmol/LNaCl、2％SDS、1mmol/LDTT、1mmol/LCaCl2和100μl蛋白酶K(10g/L)的消化液，55℃水浴72h‐120h，期间每4h震荡混匀一次，10000r/min离心10min取上清；5)以平衡酚以及氯仿：...
【专利技术属性】
技术研发人员：晁志，蔡炫，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。