一种快速提取土壤微生物RNA的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取土壤微生物RNA的试剂盒及方法。本发明专利技术的快速提取土壤微生物RNA的试剂盒及方法，先利用氢氧化铝来去除土壤中的各种杂质，再使用玻璃珠破碎土壤微生物细胞后，利用RNA吸附柱对土壤微生物RNA进行吸附，从而节省了大量的提取时间，本发明专利技术方法所用时间短，步骤少，保持RNA的完整性，且更加地方便、快捷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种快速提取土壤微生物RNA的试剂盒及方法。
技术介绍
土壤中的微生物种类繁多，数量极大，一克肥沃土壤中通常含有几亿到几十亿个微生物，贫瘠土壤每克也含有几百万至几千万个微生物，一般说来，土壤越肥沃，微生物种类和数量越多。另外，土壤表层或耕作层中及植物根附近微生物数量也较多。土壤中的渐生物主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物。土壤中的微生物以细菌数量最多，细菌占土壤微生物总量的70％～90％，而且种类多。在土壤微生物研究中，过去的研究主要集中在土壤微生物DNA的提取以及其下游反应，土壤微生物DNA的提取可以适用于所有微生物的研究，然而却无法检测到当前有活性的微生物状态，基于土壤微生物RNA的分析能更好地描述种群的代谢活性。提取纯度高河完整性好的RNA是研究微生物表达组学的重要前提。目前国内外已经有很多专门用于土壤微生物RNA提取的方法，主要分成两类，一类是依据特殊的溶液来提取RNA，另一类是根据离心柱，然而这些试剂盒大多价格较为昂贵，且需要多次试验才能成功提取到土壤微生物RNA，这给小实验室进行土壤微生物RNA研究带来很大的经济负担。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种能高效、快速提取土壤微生物RNA的试剂盒及方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：提供一种快速提取土壤微生物RNA的方法，包括如下步骤：土壤样品的前处理：取0.1-1g的土壤于2ml的离心管中，加入50-200μl Buffer A，300-900μl无菌水，300-600μl Buffer B，涡旋震荡30-60s，加入50-200μl Buffer C，100-300μl Buffer D，涡旋震荡30-60s，8000-10000g离心1-5min，去上清得沉淀A；所述Buffer A为pH为5-6的0.5-2M的Tris-Cl缓冲液；所述Buffer B为0.1-2M为包含0.1-2M的Al3+离子的溶液；所述Buffer C为包含2-6M的OH-离子的溶液；所述Buffer D为pH＝7-9的0.1-0.5M的Tris-Cl缓冲液；土壤微生物RNA的提取：所述沉淀A加入200-400μl Buffer D，0.1-1g的0.5-1mm玻璃珠，200-400μl Buffer E，200-400μl Buffer F，涡旋震荡1-3min，4℃温度条件下10000-12000g离心2-5min，取500-800ul上清液至1.5ml离心管，加入500-800μl的酚、氯仿和异戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积份数比为25:24:1，涡旋震荡30-60s，4℃温度条件下14000-16000g离心1-5min，将上清液转移至1.5ml离心管，加入上清液等体积的Buffer G混匀后得样品，将样品加到RNA吸附柱上，14000-16000g离心1-5min，去掉液体，加入500-600ul去蛋白液，14000-16000g离心1-5min，去掉液体，加入500-600ul漂洗液，14000-16000g离心1min，去掉液体，再加入500-600ul漂洗液，14000-16000g离心1-5min，去掉液体，吹干后加入30-50ul洗脱液，14000-16000g离心2-5min，收集液体得RNA溶液；所述Buffer E为10-20％的SDS溶液；所述Buffer F的配制方法为：取2-3g LiCl，1-2g Tris，3-4g EDTA，加入双蒸水溶解并调节pH为7.0-9.0，定容至100ml；所述Buffer G为溶质重量百分数为50-80％的乙醇溶液；所述去蛋白液为pH为6-7的包含4-6M盐酸胍，10-30 mM Tris-HCI的溶液，所述蛋白液中乙醇的重量百分数为30-50％；所述漂洗液为pH为7-8的包含10-30mM NaCL，1-3mM Tris-HCI的溶液，所述漂洗液中乙醇的重量百分数为80-90％；所述洗脱液为pH为6-7的5-15mM Tris-HCI溶液。本专利技术的另一技术方案为提供一种快速提取土壤微生物RNA的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、Buffer G、去蛋白液、漂洗液和洗脱液；所述Buffer A为pH为5-6的0.5-2M的Tris-Cl缓冲液；所述Buffer B为0.1-0.5M的Al2(SO4)3溶液；所述Buffer C为2-6M的NaOH溶液；所述Buffer D为pH＝7-9的0.1-0.5M的Tris-Cl缓冲液；所述Buffer E为10-20％的SDS溶液；所述Buffer F的配制方法为：取2-3g LiCl，1-2g Tris，3-4g EDTA，加入双蒸水溶解并调节pH为7.0-9.0，定容至100ml；所述Buffer G为溶质重量百分数为50-80％的乙醇溶液；所述去蛋白液为pH为6-7的包含4-6M盐酸胍，10-30 mM Tris-HCI的溶液，所述蛋白液中乙醇的重量百分数为30-50％；所述漂洗液为pH为7-8的包含10-30mM NaCL，1-3mM Tris-HCI的溶液，所述漂洗液中乙醇的重量百分数为80-90％；所述洗脱液为pH为6-7的5-15mM Tris-HCI溶液。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的快速提取土壤微生物RNA的试剂盒及方法，先利用氢氧化铝来去除土壤中的各种杂质，再使用玻璃珠破碎土壤微生物细胞后，利用RNA吸附柱对土壤微生物RNA进行吸附，从而节省了大量的提取时间，本专利技术方法所用时间短，步骤少，保持RNA的完整性，且更加地方便、快捷。附图说明图1为利用本专利技术具体实施方式的方法对3种不同作物土壤的微生物RNA提取结果图；其中泳道1，2，3分别代表水稻土壤微生物RNA、玉米土壤微生物RNA、甘蔗土壤微生物RNA。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术最关键的构思在于：本专利技术是利用氢氧化铝来去除土壤中的各种杂质，极大地减少了提取土壤微生物RNA的操作时间和土壤微生物的流失，更加地方便、快捷的提取土壤微生物RNA。实施例1一种快速提取土壤微生物RNA的试剂盒，具体步骤如下：(1)原料：新鲜水稻根际土壤，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速提取土壤微生物RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：土壤样品的前处理：取0.1‑1g的土壤于2ml的离心管中，加入50‑200μl Buffer A，300‑900μl无菌水，300‑600μl Buffer B，涡旋震荡30‑60s，加入50‑200μl Buffer C，100‑300μl Buffer D，涡旋震荡30‑60s，8000‑10000g离心1‑5min，去上清得沉淀A；所述Buffer A为pH为5‑6的0.5‑2M的Tris‑Cl缓冲液；所述Buffer B为0.1‑2M为包含0.1‑2M的Al3+离子的溶液；所述Buffer C为包含2‑6M的OH‑离子的溶液；所述Buffer D为pH＝7‑9的0.1‑0.5M的Tris‑Cl缓冲液；土壤微生物RNA的提取：所述沉淀A加入200‑400μl Buffer D，0.1‑1g的0.5‑1mm玻璃珠，200‑400μl Buffer E，200‑400μl Buffer F，涡旋震荡1‑3min，4℃温度条件下10000‑12000g离心2‑5min，取500‑800ul上清液至1.5ml离心管，加入500‑800μl的酚、氯仿和异戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积份数比为25:24:1，涡旋震荡30‑60s，4℃温度条件下14000‑16000g离心1‑5min，将上清液转移至1.5ml离心管，加入上清液等体积的Buffer G混匀后得样品，将样品加到RNA吸附柱上，14000‑16000g离心1‑5min，去掉液体，加入500‑600ul去蛋白液，14000‑16000g离心1‑5min，去掉液体，加入500‑600ul漂洗液，14000‑16000g离心1min，去掉液体，再加入500‑600ul漂洗液，14000‑16000g离心1‑5min，去掉液体，吹干后加入30‑50ul洗脱液，14000‑16000g离心2‑5min，收集液体得RNA溶液；所述Buffer E为10‑20％的SDS溶液；所述Buffer F的配制方法为：取2‑3g LiCl，1‑2g Tris，3‑4g EDTA，加入双蒸水溶解并调节pH为7.0‑9.0，定容至100ml；所述Buffer G为溶质重量百分数为50‑80％的乙醇溶液；所述去蛋白液为pH为6‑7的包含4‑6M盐酸胍，10‑30mM Tris‑HCI的溶液，所述蛋白液中乙醇的重量百分数为30‑50％；所述漂洗液为pH为7‑8的包含10‑30mM NaCL，1‑3mM Tris‑HCI的溶液，所述漂洗液中乙醇的重量百分数为80‑90％；所述洗脱液为pH为6‑7的5‑15mM Tris‑HCI溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种快速提取土壤微生物RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
土壤样品的前处理：取0.1-1g的土壤于2ml的离心管中，加入50-200μl Buffer 
A，300-900μl无菌水，300-600μl Buffer B，涡旋震荡30-60s，加入50-200μl Buffer 
C，100-300μl Buffer D，涡旋震荡30-60s，8000-10000g离心1-5min，去上清得
沉淀A；
所述Buffer A为pH为5-6的0.5-2M的Tris-Cl缓冲液；
所述Buffer B为0.1-2M为包含0.1-2M的Al3+离子的溶液；
所述Buffer C为包含2-6M的OH-离子的溶液；
所述Buffer D为pH＝7-9的0.1-0.5M的Tris-Cl缓冲液；
土壤微生物RNA的提取：所述沉淀A加入200-400μl Buffer D，0.1-1g的
0.5-1mm玻璃珠，200-400μl Buffer E，200-400μl Buffer F，涡旋震荡1-3min，4℃
温度条件下10000-12000g离心2-5min，取500-800ul上清液至1.5ml离心管，
加入500-800μl的酚、氯仿和异戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和异戊
醇的体积份数比为25:24:1，涡旋震荡30-60s，4℃温度条件下14000-16000g离
心1-5min，将上清液转移至1.5ml离心管，加入上清液等体积的Buffer G混匀
后得样品，将样品加到RNA吸附柱上，14000-16000g离心1-5min，去掉液体，
加入500-600ul去蛋白液，14000-16000g离心1-5min，去掉液体，加入500-600ul
漂洗液，14000-16000g离心1min，去掉液体，再加入500-600ul漂洗液，
14000-16000g离心1-5min，去掉液体，吹干后加入30-50ul洗脱液，14000-16000g
离心2-5min，收集液体得RNA溶液；
所述Buffer E为10-20％的SDS溶液；
所述Buffer F的配制方法为：取2-3g LiCl，1-2g Tris，3-4g EDTA，加入双
蒸水溶解并调节pH为7.0-9.0，定容至100ml；
所述Buffer G为溶质重量百分数为50-80％的乙醇溶液；
所述去蛋白液为pH为6-7的包含4-6M盐酸胍，10-30mM Tris-HCI的溶液，
所述蛋白液中乙醇的重量百分数为30-50％；
所述漂洗液为pH为7-8的包含10-30mM NaCL，1-3mM Tris-HCI的溶液，
所述漂洗液中乙醇的重量百分数为80-90％；
所述洗脱液为pH为6-7的5-15mM Tris-HCI溶液。
2.根据权利要求1所述的快速提取土壤微生物RNA的方法，其特征在于，
具体包括如下步骤：
土壤样品的前处理：取0.5g的土壤于2ml的离心管中，加入100μl Buffer A，
690μl无菌水，210μl Buffer B，涡旋震荡30s，加入100μl Buffer C，300μl Buffer 
D，涡旋震荡30s，8000g离心2min，去上清得沉淀A；
所述Buffer A为pH为5.5的1M的Tris-Cl缓冲液；
所述Buffer B为0.2M的Al2(SO4)3溶液；
所述Buffer C为4M的NaOH溶液；
所述Buffer D为pH＝8的0.1M的Tris-Cl缓冲液；
土壤微生物RNA的提取：所述沉淀A加入325μl Buffer D，0.5g的0.5-1mm
玻璃珠，325μl Buffer E，325μl Buffer F，涡旋震荡1min，4℃温度条件下11000g
离心2min，取7500ul上清液至1.5ml离心管，加入750μl的酚、氯仿和异戊醇
酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积份...

【专利技术属性】
技术研发人员：王清水，余彦，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35