用于检测肺癌的基因标志物、引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了用于检测肺癌的基因标志物，其包括SFTPB基因、FGFR1基因和FILIP1L基因。通过研究发现肺癌患者血液单核细胞中SFTPB、FGFR1和FILIP1L mRNA表达异常，其整合后对肺癌的诊断准确率达到98.3％，其诊断的特异性和灵敏度也远远优于单个基因。通过对三个基因SFTPB、FGFR1和FILIP1L血液中表达量的测定，达到肺癌的诊断(特别是早期肺癌，即肺癌已经发生，但人体基本没有症状)，辅助提高临床肺癌的检出率，降低肺癌患者的死亡率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肺癌检测
，具体涉及用于检测肺癌的基因标志物、引物、探针及试剂盒。
技术介绍
肺癌发生于支气管黏膜上皮，近几年肺癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势，已成为21世纪全球面临的严峻的健康问题。在中国，预计到2025年，肺癌患者将达到100万，居世界第1位。研究肺癌的发生、发展及治疗和预后的相关问题一直以来都是医学界面临的重要课题。目前对肺癌的早期诊断有胸部X线和胸部CT检查、痰细胞检查、纤维支气管镜检查和经皮肺穿刺活检等检查方法，由于这些临床诊断方法诊断肺癌成本较高且具有仪器的特殊性和技术限制以及检测时对患者的创伤等原因，使这些诊断方法有很多局限性，得不到广泛的应用，几乎2/3的肺癌患者在就诊时已是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)，错过了最佳治疗时期。目前关于肺癌标志物的研究也比较多，但多集中在肺癌组织及血液中的游离microRNA，尚未发展到临床诊断阶段。组织中肺癌标志物的检测需要手术或活检取得癌症组织，不适用于肺癌的早期检查或多次检查，因为一旦需要活检或手术，肺癌已经处于比较晚期，肺癌标志物诊断已无必要性。所以找到一种新的肺癌检测标志物并发展成为可供临床检测且简单实用的技术，辅助肺癌患者临床诊断，提高肺癌的诊断准确率，对肺癌的早发现早治疗具有重大的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是现有的组织中肺癌标志物检测需要手术或者活检，不适用于肺癌早期检查或多次检查，增加病人痛苦；血液标志物的诊断技术多停留在研究阶段，检测效果还有待进一步证实，尚未发展到临床诊断阶段。为解决上述技术问题，本专利技术提供了用于检测肺癌早期的基因标志物，其为三种基因的联合标志物，具体包括SFTPB基因、FGFR1基因和FILIP1L基因。通过对三个基因SFTPB、FGFR1和FILIP1L血液中表达量的测定，达到肺癌的早期诊断(肺癌已经发生，但人体基本没有症状)，辅助提高临床肺癌的检出率，降低肺癌患者的死亡率。SFTPB、FGFR1和FILIP1L分别在不同的研究中发现其与肺癌相关。其中SFTPB是一种亲表面活性蛋白，蛋白质组学研究表明SFTPB的血浆水平与肺癌的临床已知独立的危险因素相关，是非小细胞肺癌一种很有前途的血液标记物。此外，SFTPB与早期肺癌有关，提示在早期潜在非小细胞肺癌的肿瘤是否适合于手术切除。FGFR1是一种成纤维细胞生长因子受体，它的表达可以减少细胞凋亡，促进癌细胞的存活，是早期鳞状细胞肺癌的一个独立的不良预后标物。FILIP1L是一种细丝蛋白，可以通过抑制基质金属蛋白酶的表达，从而抑制癌细胞的侵袭和转移，在肺癌组织中FILIP1L蛋白和调控FILIP1L蛋白的mRNA表达水平低于正常组织。目前的研究仅停留于SFTPB、FGFR1和FILIP1L蛋白的含量与肺癌不同分型的相关性。本研究通过大量的前期研究，筛选得到血液单核细胞中SFTPB、FGFR1和FILIP1L基因表达与肺癌显著相关，并且可用于辅助肺癌的早期诊断，三个基因标志物整合后，其对早期肺癌的诊断准确率可达到98.3％，且适用于不同分型肺癌的诊断。本专利技术提供的用于检测肺癌的引物和探针，包括SFTPB引物探针组、FGFR1引物探针组和FILIP1L引物探针组，核苷酸序列如下：SFTPB引物探针组：上游引物：SEQIDNO:1(5’-CAGAAACTACAGACAAAGAGAGTGGAA-3’)，下游引物：SEQIDNO:2(5’-TTCAGTTGCTTCAGGCCATCT-3’)，探针：SEQIDNO:3(5’-CAGGCCTCTGAGCCCAAGCTAAGCC-3’)；FGFR1引物探针组：上游引物：SEQIDNO:4(5’-CACGGGACATTCACCACATC-3’)，下游引物：SEQIDNO:5(5’-ACCCCGAAAGACCACACATC-3’)，探针：SEQIDNO:6(5’-ACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGC-3’)；FILIP1L引物探针组：上游引物：SEQIDNO:7(5’-CATCCCTGAAACACCTTGATTTTAT-3’)，下游引物：SEQIDNO:8(5’-TCAAGGCTTAAAACAACATCCATTT-3’)，探针：SEQIDNO:9(5’-AAGCCACGCTGTATCTGGACTTCTGATCTG-3’)；其中，探针的核苷酸序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。优选地，所述荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。本专利技术提供的一种肺癌检测试剂盒，包括以上所述的用于检测肺癌的引物和探针。为方便荧光定量PCR检测，试剂盒中优选还包括Taqman反应缓冲液、dNTPs、Mg2+等。优选地，上述肺癌检测试剂盒，还包括内参基因GAPDH的检测引物和探针，其具体核苷酸序列为上游引物：SEQIDNO:10，下游引物SEQIDNO:11，探针：SEQIDNO:12；探针的核甘酸序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。荧光报告基团优选FAM，荧光淬灭基团优选TAMRA。SEQIDNO:10(5’-GCATCCTGGGCTACACTGAG-3’)；SEQIDNO:11(5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’)；SEQIDNO:12(5’-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACCC-3’)。优选地，上述肺癌检测试剂盒，还包括阳性对照品，阳性对照品包括梯度浓度的SFTPB基因、FGFR1基因、FILIP1L基因以及GAPDH基因。优选地，上述肺癌检测试剂盒，还包括UniversalPCRMasterMix和RNase-freewater。这两种试剂均为市售商品。本专利技术还提供了以上任一所述的肺癌检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)提取样本总RNA，逆转录合成cDNA；(2)以cDNA为模板，分别使用权利要求2所述的用于检测肺癌的引物和探针进行荧光定量PCR反应，收集荧光信号，获取FGFR1基因、SFTPB基因和FILIP1L基因的表达量；当试剂盒中含有内参基因时，使用内参基因GAPDH的检测引物和探针进行荧光定量PCR反应，GAPDH基因的PCR反应结果用于对三个目的基因的测定结果进行归一化，校正由起始取样量导致的Ct值差异；(3)计算联合预测因子：联合预测因子的表达式为：y＝1.77x1+3.68x2-x3，其中y表示联合预测因子，x1表示样本FGFR1基因用内参基因归一本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测肺癌的基因标志物，其特征在于，包括SFTPB基因、FGFR1基因和FILIP1L基因。

【技术特征摘要】
1.用于检测肺癌的基因标志物，其特征在于，包括SFTPB基因、FGFR1
基因和FILIP1L基因。
2.用于检测肺癌的引物和探针，其特征在于，包括SFTPB引物探针组、
FGFR1引物探针组和FILIP1L引物探针组，核苷酸序列如下：
SFTPB引物探针组：
上游引物：SEQIDNO:1，
下游引物：SEQIDNO:2，
探针：SEQIDNO:3；
FGFR1引物探针组：
上游引物：SEQIDNO:4，
下游引物：SEQIDNO:5，
探针：SEQIDNO:6；
FILIP1L引物探针组：
上游引物：SEQIDNO:7，
下游引物：SEQIDNO:8，
探针：SEQIDNO:9；
其中，探针的核苷酸序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的用于检测肺癌的引物和探针，其特征在于，所述
荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。
4.一种肺癌检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的用于检
测肺癌的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的肺癌检测试剂盒，其特征在于，还包括内参基因
GAPDH的检测引物和探针，其具体核苷酸序列为上游引物：SEQIDNO:10，
下游引物SEQIDNO:11，探针：SEQIDNO:12；探针的核甘酸序列5’端标记
荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。
6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王义明，罗国安，
申请(专利权)人：王义明，
类型：发明
国别省市：北京;11