一种红铃虫抗性基因AQ65检测引物组、试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术涉及一种红铃虫抗性基因AQ65检测引物组、试剂盒及使用方法，由DNA提取液，PCR反应液，标准阳性模板、红铃虫基因特异性引物、阴性质控标准品组成。可用于检测红铃虫田间种群中具有上述突变类型的抗性基因个体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测
，具体而言，本专利技术涉及一种红铃虫抗性基因AQ65检测引物组、试剂盒及使用方法。
技术介绍
中国是世界上最大的棉花生产国，自1997年种植转Bt基因棉花以来，现全国年种植面积已达550万hm2，在全世界居第二位，仅次于印度[1]。根据中棉所、全国优质棉科技服务项目组2007年对全国16个产棉省(市区)的调查结果，全国棉花播种品种471个，其中转基因抗虫棉157个，占全部品种的33.3％，其播种面积占总播种面积的66.1％。但值得注意的是，在这些转基因棉花品种中，除少数品种外为转CryIA+CpTI双价抗虫棉外，绝大多数品种都为转单价Bt基因棉。而且在157个转基因抗虫棉品种中，除了其中4个为美国引进品种，其他几乎所有品种的基因来源高度集中，基本都是CryIA基因。按照科学规律，单价抗虫棉在大田生产上一般只能安全应用8～10年，而转基因抗虫棉在中国种植时间已达10多年，红铃虫对Bt基因产生抗性的风险已越来越大。因此鉴定田间靶标昆虫对Bt棉花产生的抗性基因类型、监测其抗性基因频率的变化，有助于及时掌握田间种群对Bt棉化的抗性发展情况，研究与制定合理的抗性治理措施，以延缓害虫对Bt棉花抗性的产生。
技术实现思路
红铃虫对Bt蛋白产生抗性目前已知的主要表现为钙粘蛋白基因突变。从基因BANK中可以查知，红铃虫的突变类型已达到了23种(见表1)。近年来，我们从长江流域田间种群中筛选并纯化出一个红铃虫Cry1Ac抗性品系，即AQ65品系(cDNA:KU254193；gDNA:KU254195)，该抗性品系由钙粘蛋白基因突变导致红铃虫对Cry1Ac蛋白不敏感。具体突变情况如下：与敏感品系红铃虫(AS)(登陆号：AY198374.1)相比，AQ65品系红铃虫钙粘蛋白的基因组序列插入284个碱基，导致其cDNA序列第3195～3236、3252～3284、3295～3298的79个碱基缺失，提前引入终止密码，导致蛋白翻译提前终止(见图1)。经基因序列比对表明，该突变基因与基因BANK中已注册的红铃虫所有钙粘蛋白基因均不相同，故其为一种新的抗性基因。表1基因BANK中已注册的红铃虫钙粘蛋白抗性基因种类cDNA登录号基因组DNA登录号BtR-sAY198374.1r1AY713483.1AY713482.1r2AY713484.1AY707869.1r3AY713485.1AY707867.1,HQ585015.1r4JQ279500.1r5AKJ480757.1KJ724990.1r5BKJ480758.1KJ724991.1r5CKJ480759.1KJ724992.1r6AKJ480760.1r7AKJ480761.1r7BKJ480762.1KJ724994.1r8AKJ480763.1KJ724995.1r8BKJ480764.1KJ724996.1r9AKJ480765.1KJ724997.1r9BKJ480766.1KJ724998.1r10AKJ480767.1KJ724999.1,KJ725000.1r10BKJ480768.1KJ725001.1r10CKJ480769.1KJ725002.1r11AKJ480770.1KJ725003.1r11BKJ480771.1KJ725004.1r12AKJ480772.1r12BKJ480773.1KJ725005.1r12CKJ480774.1KJ725006.1,KJ725007.1r12DKJ480775.1KJ725008.1为检测红铃虫田间种群中存在的该突变体，我们开展了该基因的分子检测技术研究。根据AQ65品系与敏感品系(AS)钙粘蛋白基因组序列的差异，我们设计出一对特异性引物用于检测抗性基因(AQ65F：TGGCTTCGGTAAAGACGCTAT，AQ65R：TGGGATTACGGGCGTGAGT)，用该引物对AQ65抗性个体(含抗性杂合子和抗性纯合子)进行PCR扩增，结果表明，所有AQ65抗性个体均能扩出833bp的目标片段，而AS敏感品系均不能扩出片段(扩增条件见图2)。同时，我们还设计了另外一对特异性引物(AQ65F2：5'CAATGGAAAGCACTGAAGGC3'，AQ65R2：5'GCTGGAGAAGAAATGGCAAGA3')，用于区别在含有AQ65抗性基因个体的条件下，该个体是杂合子还是纯合子。用上述引物(AQ65F,AQ65R)检测出含有抗性基因的个体后，再用特异性引物(AQ65F2,AQ65R)进行扩增，杂合子个体均能扩出两条目标片段，分别为774bp与490bp，而抗性纯合个体则只能扩出一条774bp的目标条带。该结果表明，所设计的两对引物能很好地检测出AQ65品系中抗性基因的存在，并确认它们的存在状态(纯合还是杂合)，故可用于生产实践(具体方法附后)。参见附图3所述AQ65抗性基因的分子检测方法可用于检测红铃虫田间种群中具有上述突变类型的抗性基因个体。附图说明图1是AQ65品系抗性基因结构及其与敏感品系序列对比图；图2是AQ65基因分子检测电泳图；图3是AQ65杂合子分子检测电泳图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。1、实验试剂与仪器实验试剂：DNA提取试剂盒购于北京天根生物科技公司。LATaqDNA聚合酶与dNTP均购于宝生物工程(TaKaRa)大连有限公司。实验仪器：普通PCR仪购于东胜创新科技有限公司，凝胶成像仪购于美国伯乐Bio-Rad公司，电泳仪购于北京六一仪器厂。2、特异引物引物一：用于检测红铃虫田间种群中是否存在已知类型的抗性基因突变(包含抗性纯合子和抗性杂合子)上游引物AQ65F：TGGCTTCGGTAAAGACGCTAT，下游引物AQ65R：TGGGATTACGGGCGTGAGT引物二：用于确认检测到的抗性突变个体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红铃虫抗性基因AQ65检测引物组，其特征在于，包括下述引物：上游引物AQ65F：TGGCTTCGGTAAAGACGCTAT，下游引物AQ65R：TGGGATTACGGGCGTGAGT；和上游引物AQ65F2：5'CAATGGAAAGCACTGAAGGC 3'，下游引物下游引物AQ65R2：5'GCTGGAGAAGAAATGGCAAGA 3'。

【技术特征摘要】
1.一种红铃虫抗性基因AQ65检测引物组，其特征在于，包括下述引物：
上游引物AQ65F：TGGCTTCGGTAAAGACGCTAT，
下游引物AQ65R：TGGGATTACGGGCGTGAGT；
和
上游引物AQ65F2：5'CAATGGAAAGCACTGAAGGC3'，
下游引物下游引物AQ65R2：5'GCTGGAGAAGAAATGGCAAGA3'。
2.一种红铃虫抗性基因AQ65检测试剂盒，其特征在于，包括：由DNA提
取液，PCR反应液，标准阳性模板，阴性质控标准品，权利要求1所述引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括LATaq
酶、10×LATaq缓冲液(Mg2+Plus)、dNTPs和无菌双蒸水。
4.权利要求2所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)基因组DNA样品制备；
2)PCR检测；
其中所述试剂盒包括DNA提取液，标准阳性模板，阴性质控标准品，PCR
反应液，引物组。
5.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)基因组DNA样品制备
样品来源：田间采集到的红铃虫个...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玲，万鹏，吴孔明，王金涛，丛胜波，许冬，黄民松，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院植保土肥研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42