检测治疗剂抗性微生物的试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法，其包括以下步骤：a.在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品，优选进一步包括至少一种溶解剂和/或缓冲剂，和/或合适的培养基，或将样品置于分离血清管上，并且进行培养；b．将荧光标记物加入两个试管中；c．为了获得两个试管各自的一个或多个荧光或生长参数，进行荧光分析；其中通过比较这两个试管之间的一个或多个荧光参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。因此，本发明专利技术在用于检测不同微生物对治疗剂的易感性的实验室程序或常规程序中是有用的，以确定微生物抗性机制乃至评价生物样品中的抗微生物药物的量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及一种用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法，其包括以下步骤：a.在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品，优选进一步包括至少一种溶解剂和/或缓冲剂，和/或合适的培养基，或将样品置于分离血清管上，并且进行培养；b．将荧光标记物加入两个试管中；c．为了获得两个试管各自的一个或多个荧光或生长参数，进行荧光分析；其中通过比较这两个试管之间的一个或多个荧光参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。因此，本专利技术在用于检测不同微生物对治疗剂的易感性的实验室程序或常规程序中是有用的，以确定微生物抗性机制乃至评价生物样品中的抗微生物药物的量。【专利说明】专利技术的
本专利技术涉及，以及基础抗性机制的确定。专利技术背景现今，对简化和改进用于微生物的检测并且尤其是易感性评价的通用实验室程序存在主要的需求。理想的诊断技术将及时地给出易感性特征剖析，使得可以基于此制定合适的治疗。就最严重的感染(B卩，与脓毒性休克相关)而言，速度是根本。已经表明如果耽误了合适的抗微生物治疗,则死亡率的风险将会按钟点大大地增加。通用的金标准诊断方法是基于培养，其是缓慢、劳动密集型的，提供表型鉴定和抗微生物易感性测试，在样品收集后需要48-72小时。常常不得不启动使用广谱抗生素的经验主义治疗，导致抗微生物剂抗性的提高。使用经典测试，必须在固体培养基上培养生物制品，如尿液，然后才能进行鉴定和易感性评价。血液通常被接种于肉汤培养基上(血液培养)，并且自动分析；当呈阳性时，将它们涂布在固体培养基上，并且只有在至少24小时后，才能形成菌落，用于易感性评价。另一方面，对于易感性特征剖析测定，还需要另外的24小时，因为它们是基于在一组药物存在下的生长能力。临床抗性可能与菌株缺乏抗微生物剂易感性相关，但也与感染局部的低水平活性抗微生物药物相关。生物化学方案只对几种药物是有用的，例如，万古霉素、庆大霉素或氨丁卡霉素，并且它们可能是无活性的。专利技术概述本专利技术涉及通过流式细胞术对纯微生物培养物进行的抗微生物剂易感性检测，所述培养物是含有单个生物体物种的实验室培养物，或直接来自未培养的生物样品。一些优选的实施方案不需要使用获自生物制品的纯培养物来进行，纯培养物至少需要24小时使微生物生长，因此，与流式细胞术一样，通过荧光分析，从未培养的生物样品(如，尿液、血液培养物或水)直接进行抗微生物剂易感性检测。所公开的主题涉及用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法，包括以下步骤:a.在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品，并且进行培养；b.将荧光标记物加入两个试管中；c.为了获得两个试管各自的一个或多个荧光或生长参数,进行荧光分析；其中通过比较这两个试管之间的一个或多个荧光参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。所公开的主题还涉及用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物(细菌、真菌或原生生物)的方法。即，直接来自未培养的生物样品，如尿液、血液培养物、水的样品或获自纯培养物的微生物悬浮液，所述方法包括以下步骤:a.在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品；优选进一步包括至少一种溶解剂和/或缓冲液，和/或合适的培养基，或将样品置于分离血清试管上；并且进行培养；b.将荧光标记物加入两个试管中；c.为了获得两个试管各自的一个或多个流式细胞术参数，进行流式细胞术分析；其中通过比较这两个试管之间的一个或多个流式细胞术参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。在其他实施方案中，所述一个或多个流式细胞术参数包含前向散射和/或侧向散射和/或荧光参数。所述荧光散射信号的参数可以是强度、光谱特征剖析和/或细胞计数。在本专利技术的其他实施方案中，所公开的方法进一步包括如下准备步骤中的一个或多个:?鉴定所述生物样品中存在的微生物的类型，并且据此选择一种或多种治疗剂，即，所述类型是革兰氏阳性还是革兰氏阴性；?将所述生物样品浓缩，并且如果存在，除去任何碎片，例如，来自血样、尿液或其他生物制品的碎片；优选通过离心、过滤或使用分离血清试管和离心。在本专利技术的另一个实施方案中，样品的培养时间可以为30分钟-2小时,优选30-60分钟。在本专利技术的另一个实施方案中，样品的培养温度为30-40°C,优选25-35°C。在本专利技术的另一个实施方案中，使用荧光标记物的步骤b)的反应时间为5-60分钟。在本专利技术的另一个实施方案中，为了确定微生物抗性机制，步骤c)中的生物样品可以进一步包含酶抑制剂，例如，在检测超广谱内酰胺酶(ESBL)存在的情况下。优选的酶抑制剂特别是棒酸或三唑巴坦，或其混合物。在本专利技术的另一个优选方面中，为了检测微生物抗性机制，例如，由于碳青霉烯酶(降解碳青霉烯的酶)的存在，重要的抗性机制(推荐Hodge检测，需要另外24小时，是麻烦的且难以解释)，所述方法进一步包括以下步骤:1.给所述样品接种碳青霉烯，并且进行培养；i1.除去生物样品的微生物，优选通过过滤；ii1.添加具有己知行为的菌株-即，具有己知剂量-效应曲线的对照菌株，例如通过流式细胞术，用例如大肠杆菌，ATCC菌株25922这样的微生物培养一系列浓度的碳青霉稀;iv.将荧光标记物加入两个样品中；V.为了获得两个试管各自的一个或多个流式细胞术参数，进行流式细胞术分析；v1.将产生的特征剖析与对照菌株进行比较，在碳青霉烯酶存在的情况下，测试的菌株将降解碳青霉烯，因此活性药物减少；碳青霉烯对该类型菌株的作用降低。如果特定浓度的碳青霉烯的作用次于预期的，那么微生物是碳青霉烯酶生产者。在本专利技术更优选的实施方案中， 为了检测微生物抗性机制，例如，由于碳青霉烯酶的存在，所述方法进一步包括以下步骤:?通过流式细胞术，用微生物(如，大肠杆菌，ATCC菌株25922)培养一系列浓度的碳青霉烯，获得流式细胞术剂量-效应曲线；?用特定浓度的碳青霉烯培养后，将抗性株朝向碳青霉烯，通过过滤从含有菌株的试管中除去微生物；?现在用类型菌株(ATCC)培养该滤液，并且通过流式细胞术分析其效应；将其效应与关于剂量-应答曲线的预期结果相比较。在另一个优选的实施方案中，可以基于相同的方法，进一步评价生物流体中治疗量的任何药物。在用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法的最优选实施方案中，所述微生物是葡萄球菌属(Staphylococcus spp)、链球菌属(Streptococcus spp)、肠球菌属(Enterococcus spp);肠杆菌科(Enterobacteriacea),如大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、变形杆菌属(Proteus spp);不可发酵的细菌， 如绿胺假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baummanii)或Burkloderia cepaciae ;奈瑟氏菌属(Neisseria spp)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp)；分枝杆菌属(Mycobacterium spp)和诺卡氏菌属(Nocardia spp);军团菌属(Legionellaspp)和厌氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测生物样品中治疗剂抗性微生物的方法，包括以下步骤：a.在含有至少一种治疗剂的第一个试管和不含至少一种治疗剂的第二个试管上接种所述样品，并且进行培养；b.将荧光标记物加入两个试管中；c．为了获得两个试管各自的一个或多个荧光参数，进行荧光分析；其中通过比较这两个试管之间的一个或多个荧光参数获得生物样品对所述治疗剂的微生物抗性表型。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·I·阿泽维多皮纳瓦，A·阿戈什蒂纽贡萨尔维斯，I·C·桑托斯席尔瓦德法里娅拉莫斯安图尼斯，R·M·多斯桑托斯罗查多罗萨里，A·S·金唐埃科斯塔德奥利维拉莫赖斯，A·T·平托埃席尔瓦，
申请(专利权)人：波尔图大学，
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