一种B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法及其试剂盒和应用技术

本发明专利技术公开了鸡标记辅助选择领域中的一种B亚群禽白血病的分子标记鉴别方法及其试剂盒和应用。该分子标记为鸡tvb基因的DNA片段上第166位SNP位点(C/T)，通过进行PCR-RLFP分析，检测该C/T突变位点是否发生突变来鉴别被检测鸡为遗传抗性型还是遗传易感型，能准确鉴别目标鸡群B亚群禽白血病抗性的基因型，从而能有目的对鸡群进行选择，提高其后代鸡的B亚群禽白血病抗病性。本发明专利技术的鉴别方法和试剂盒准确性高、成本低、效率高。通过本发明专利技术的鉴别方法和试剂盒，有利于判断目标鸡群对B亚群禽白血病抗性性状的基因型，从而能有目的对鸡群进行选择，提高其后代鸡群对B亚群禽白血病的抵抗力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鸡标记辅助选择
，具体涉及一种用于鸡标记辅助选择的B亚 群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法及其试剂盒和应用。
技术介绍
禽白血病(Avian leucosis，AL)主要是由禽白血病病毒(Avian leucosis virus, ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的一类免疫抑制性肿瘤性传染病。禽白血病病毒不仅 引发肿瘤，导致鸡群大批死亡，禽白血病病毒亚临床感染还常常引发生产性能，包括生长 率、肉品质、产蛋率和受精率等降低、鸡免疫抑制和易致其他病原继发感染，给养禽业造成 重大的经济损失。 目前，由于没有有效药物和疫苗，禽白血病的主要防控措施是降低鸡群的感染率 以及建立无白血病的种鸡群，其主要手段是通过对鸡群定期进行禽白血病病毒(ALV)检测 淘汰阳性鸡的方法来净化和消除鸡群中的ALV。然而，禽白血病净化是一项成本昂贵、工作 量大且持久的工程;尤其在生产系统低下且养殖环境复杂的发展中国家，净化措施并不能 完全控制禽白血病的发生与流行。因此，通过抗病育种改善宿主抗病力被人们认为是防控 禽白血病的一项新策略。 B亚群禽白病病毒是我国肉鸡主要流行的禽白血病病毒之一。研究表明，B亚群禽 白病病毒通过与宿主上的特异性受体结合侵染动物机体，编码B亚群禽白病病毒受体的tvb 基因突变与禽白血病抗性相关，如位于c.172C>T突变使受体基因 tvb产生提前终止密码子， 影响受体与病毒的结合，从而使宿主产生抗B亚群禽白血病病毒感染的能力。我们前期在 tvb基因第4外显子上发现一个新突变C.298C>T，该突变同样可导致tvb产生提前终止密码 子，从而使宿主产生B亚群禽白血病病毒抗性。但目前关于tvb基因 C.298C>T位点作为B亚群 禽白血病遗传抗性分子标记的检测方法研究还较少。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种鸡B亚群禽白血病抗性的分子标记鉴 别方法及其试剂盒和应用。 本专利技术以鸡B亚群禽白血病病毒受体基因 tvb的DNA全长序列（参考序列GeneBank 登录号为NC_006109.3)为研究对象，寻找该受体基因上影响鸡B亚群禽白血病抗性突变位 点以及相应的多态性检测方法，通过在多个群体中的验证，发现了位于鸡B亚群禽白血病病 毒受体基因 tvb的某段序列（SEQ ID N0:3)中的第166位碱基具有单核苷酸多态性。且当该 处碱基为C时，鸡为B亚群禽白血病易感型，当该处碱基为T时，鸡为B亚群禽白血病抗性型。 本专利技术的第一个目的是提供一种B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法， 通过检测鸡tvb基因的DNA片段上的第166位SNP位点是否发生突变来鉴别被检测鸡为遗传 抗性型还是遗传易感型； 当所述鸡tvb基因的DNA片段上的第166位碱基为C时，则判断所述鸡为B亚群禽白 血病易感型；当所述鸡tvb基因的DNA片段上的第166位碱基为T时，则判断所述鸡为B亚群禽 白血病抗性型。 优选的，所述方法包括如下步骤： (1)以所述鸡tvb基因的DNA序列为模板，设计引物对所述鸡tvb基因的DNA片段进 行扩增； (2)将所得扩增产物用限制性内切酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测所得酶切产 物； 若只有一条509bp的条带，则该突变位点处均为C碱基，判断为CC基因型，表现为B 亚群禽白血病敏感型； 若有2条分别为343bp和166bp的条带，则该突变位点处均为T碱基，判断为TT基因 型，表现为B亚群禽白血病抗性型； 若有3条分别为509bp、343bp和166bp的条带，则该突变位点处一条链为C碱基，另 一条链为T碱基，判断为CT基因型，因为C等位基因是显性，所以表现为B亚群禽白血病敏感 型。 优选的，所述步骤(1)中的引物如SEQ ID N0:1~2所示： 正向引物：5，-ATGTGGGCAAGGTAAAACTC-3，， 反向引物：5'-GGTGATGATGATCCATAAAGC-3'。优选的，所述步骤(2)中的限制性内切酶为BsaA頂每。 本专利技术的第二个目的是提供一种B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别试剂 盒，所述试剂盒包含正向引物和反向引物、PCR反应混合物、Taq DNA聚合酶、双蒸水、缓冲液 和限制性内切酶BsaA I，所述正向引物和反向引物的序列为： 正向引物：5，-ATGTGGGCAAGGTAAAACTC-3，，反向引物：5，-GGTGATGATGATCCATAAAGC-3，。本专利技术的第三个目的是提供B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法在分子 标记辅助选择中的应用，特别是在鸡B亚型禽白血病抗性选择育种中的应用。本专利技术的鉴别方法和试剂盒准确性高、成本低、效率高。通过本专利技术的鉴别方法和 试剂盒，有利于判断目标鸡群对B亚群禽白血病抗性性状的基因型，从而能有目的对鸡群进 行选择，提高其后代鸡群对B亚群禽白血病的抵抗力。【附图说明】图1是鸡tvb基因上的DNA片段PCR扩增后的电泳结果图，其中，泳道L1、L2代表2只 白来航鸡，泳道Y1、Y2代表2只北京油鸡，Μ为分子量标准；图2是应用本专利技术的方法对白来航鸡和北京油鸡的tvb基因片段进行比对的结果 图，其中，L1、L2代表白来航鸡，Y1、Y2代表北京油鸡，图中方框所示的为该序列在166位碱基 处存在的C/T突变位点；图3是PCR产物用BsaA頂每进行酶切反应后的三种基因型CC、CT和ΤΤ的电泳图谱，Μ 为分子量标准。【具体实施方式】为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这 些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1:鸡B亚群禽白血病抗性分子检测方法的建立( -）引物： 以鸡tvb基因的DNA序列（参考序列GeneBank登录号为NC_006109.3)为模板，设计 一对引物扩增得到如序列SEQ ID N0:3所示的DNA序列，包括完整的第4、5外显子，部分第6 外显子，以及部分第3外显子和完整的第4、5内含子，该序列全长为509bp。所用到的引物序 列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示，具体如下： 正向引物：5，-ATGTGGGCAAGGTAAAACTC-3，， 反向引物：5，-GGTGATGATGATCCATAAAGC-3，。(二)PCR 扩增条件： 总体积为25μ1的PCR反应体系中加入DNA模板2yl、2XPCR反应混合物12.5μ1、2πιΜ dNTP混合物5μ1、10mM引物前后各0.75μ1、K0D酶0.5U、双蒸水3.5μ1，PCR反应条件为：95°C 预变性5min;94°C变性30s，62°C退火45s，72°C延伸lmin，共35个循环;最后72°C延伸7min，4 °C保存。(三）寻找分子标记：优选的，具体实验步骤如下： 1、选取国外品种白来航鸡2只和地方品种北京油鸡2只的血液DNA做模板，进行PCR 扩增，PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，图1是鸡tvb基因上的DNA片段PCR 扩增后的电泳结果图，其中，泳道LI、L2代表2只白来航鸡tvb基因 PCR扩增片段，泳道Yl、Y2 代表2只北京油鸡tvb基因 PCR扩增片段，Μ为分子量标准。 2、PCR产物的纯化:在紫外灯下从低本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种B亚群禽白血病抗性相关的分子标记鉴别方法，其特征在于，通过检测鸡tvb基因的DNA片段上的第166位SNP位点是否发生突变来鉴别被检测鸡为遗传抗性型还是遗传易感型；当所述鸡tvb基因的DNA片段上的第166位碱基为C时，则判断所述鸡为B亚群禽白血病易感型；当所述鸡tvb基因的DNA片段上的第166位碱基为T时，则判断所述鸡为B亚群禽白血病抗性型。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王劼，瞿浩，舒鼎铭，罗成龙，王艳，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物科学研究所，广东智威农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44