本发明专利技术属于生物技术领域，特别涉及一种扩展青霉核酸序列定性标准样品及其制备方法。采集对数生长期的扩展青霉，提取总DNA，进行特异性PCR扩增测序后，对质粒进行制备。本发明专利技术方法制备出的核酸序列标准样品不再具有生物活性，不存在生物污染和传染的问题，解决了分子生物学阳性对照的来源问题，且样品稳定，无污染，易保存。本发明专利技术根据扩展青霉具有分类学意义的核酸序列技术指标，解决扩展青霉核酸序列标准样品溯源参照系与参照指标问题，并应用于本标准样品的定值分析中，获得具有真正溯源意义的扩展青霉核酸序列标准样品，在国内核酸序列分类定级标准样品的研制方面具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别涉及一种扩展青霉核酸序列定性标准样品及其制 备方法。
技术介绍
世界粮农组织(FA0)报告，全球每年约有25%的农作物遭受真菌及其真菌毒素污 染，约有2%的农作物因污染严重而失去营养价值和经济价值，由此估算，全球每年因真菌 毒素污染而造成的直接及间接损失将可能达到数百亿美元。 棒曲霉素(？3七以1^11)又称展青霉素，化学名称为4-羟基-4!1呋吡喃-2(6!〇-酮，是青霉属（PeniciIlium)、曲霉属(Aspergillus)和丝衣霉属（Byssochlamys)等多种真 菌的一种次级代谢产物。20世纪50年代，人们发现棒曲霉素不仅大量污染粮食饲料，而且 对苹果及其制品的污染严重。研究已证明，棒曲霉素是一种可引起动物致畸、致癌及致突变 毒素，人体摄入棒曲霉素后会出现呕吐和胃刺激等不良症状，世界卫生组织严格规定食品 中棒曲霉素量<50yg/L。我国GB2761-2011中规定水果及其制品、饮料类和酒类中棒曲霉素 的限量为50yg/kg。棒曲霉素广泛存在于多种食品加工原料中，尤其在浓缩果汁加工原料的 产品中最为突出。棒曲霉素的传统检测主要是培养法，耗时长，无法实现快速检测的目的， 目前，全球还没有对棒曲霉素的现场、快速、实时的检测方法，都还应用液相色谱法来检测， 其需要的时间长，对现场控制没有时效性。 真菌毒素是困扰食品安全的大问题，但是目前针对真菌毒素检测的化学方法无法 检测还未产生毒素但携带毒素基因的潜在产毒真菌，而分子生物学方法则可以快速筛选， 预先排除存在的产毒真菌，从而避免粮食、食品的大面积的污染。但是由于真菌孢子易于飘 散，极易污染且难以消除等特性，需要特殊的操作空间，一些实验室不具备相应的工作条 件，检测工作难以完成。 近年来PCR技术在微生物的检测方面具有明显优势。ITS(Internal Transcribed Spacer):内转录间隔区，是真菌核糖体RNA(rRNA)基因非转录区的一部分。用于真菌鉴定的 ITS序列通常包括ITS1、5 .8 S和ITS24DNA上的5 .8S、18S和28S rRNA基因有极大的保 守性，即存在着广泛的异种同源性。而由于ITS区不加入成熟核糖体，所以ITS片段在进 化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异，在绝大多数的真核生物中 表现出了极为广泛的序列多态性，即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上 表现出差异，显示最近的进化特征。研究表明，ITS片段的进化速率是18 S rDNA的10 倍，这就是ITS序列在微生物种类鉴定和群落分析的理论基础。ITS1和ITS2是中度保守 区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。这种特点使ITS适合于 真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。由 于ITS的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，同时ITS序列 片段较小、易于分析，目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究 中。ITS的序列分析还有效地解决真菌应用形态学特征进行分类所引起的纷争，弥补了传 统分类上的一些不足。 另外，目前已研制的分类定级国家标准样品多数溯源至相应的文字标准，生物类 定性标准样品多数溯源至公认的测试方法，部分国家标准样品没有溯源性的描述。对2010 年~2015年批准的146项分类定级国家标准样品溯源性描述的调查表明：无溯源性描述内 容的35项，溯源至测试方法标准的102项，溯源至核酸序列的22项，溯源至产品标准的5项， 溯源至计量基准的1项，溯源至权威专家的1项。分类定级国家标准样品溯源性描述的状况 说明人们对这类标准样品的溯源性认识和理解上处于比较混乱的阶段，还没有一个统一的 规范。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足问题，提供一种生物和产毒信息明确的扩展青霉核 酸序列定性标准样品制备方法，同时采用标准物质分类定级理论，建立扩展青霉核酸序列 定性标准样品定值溯源参照系与参照指标。本专利技术的另一目的是提供一种扩展青霉核酸序 列定性标准样品的制备方法。 本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是:一种扩展青霉核酸序列定性标准样 品，其特征在于:所述扩展青霉核酸序列定性标准样品包含的序列为： 内转录间隔区基因（ITS)序列： TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTAT TTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTTACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAG ACACCCTCGAACTCTGTCTGAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCT TGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCT TTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTT GTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCGATCTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGC GTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCT CGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA； 核糖体rRNA 18S基因（18S)序列： GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAACTTGTACTGTGAAACTGCGA ATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATA CATGCTAAAAACCCCGACTTCAGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGA ATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGAT GGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAA CGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAC TGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCA AGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种扩展青霉核酸序列定性标准样品，其特征在于：所述扩展青霉核酸序列定性标准样品包含的序列为：内转录间隔区基因（ITS）序列：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATTTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTTACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCTCGAACTCTGTCTGAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCGATCTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA；核糖体rRNA 18S基因（18S）序列：GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAACTTGTACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCAGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGGATTCTATAATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGG GGAGTATGGT CGCAAGGCTG AAACTTAAAG AAATTGACGG AAG；核糖体rRNA 28S基因（28S）序列：GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCTCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTATTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGTCGGTCAAAGGCCCTCGGAAGGTAACGCCCCTAGGGGCGTCTTATAGCCGAGGGTGCAATGC...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑艳，蒋丹，孙晓飞，颜怀玉，郑江，
申请(专利权)人：刘淑艳，蒋丹，孙晓飞，颜怀玉，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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