本发明专利技术提供了滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用。选用前列腺特异抗原(PSA)为模型目标分子。引物-纳米金-适配体/PSA/PSA抗体夹心结构的构建引发了滚环扩增反应，从而生成成千上万的聚胸腺嘧啶重复序列，以作为合成铜纳米颗粒的模板；进一步对形成的铜纳米颗粒用硝酸进行溶解，并用电化学方法对溶解得到的铜离子进行检测，最终实现对目标物PSA含量的确定。得益于所设计的信号级联放大策略，本方法检测PSA的线性范围为0.05fg/mL-500fg/mL，检测限为0.020±0.001fg/mL PSA。最终，我们通过检测临床血清样品中的PSA含量对本方法的可实用性进行了验证。本方法的超灵敏度、特异性、以及检测实际样品的能力使其在疾病诊断应用中展示了巨大潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法 及其在电化学检测中的应用。
技术介绍
基于目标分子和生物识别分子之间的特异性相互作用对疾病的生物标志物进行 检测对临床诊断有重要意义。通常，通过光学方法和电化学方法可以实现将这种生物绑定 作用转换为可测量的信号。其中，光学方法具有高灵敏度，然而，这种信号转换方式不仅需 要高精度的昂贵的仪器，也涉及到复杂的数值算法来分析数据，因此限制了这种方法的广 泛应用。而电化学装置也能把生物反应转换成可检测的电信号，而且为医疗诊断提供了一 个简单、准确和便宜的平台，并且很有可能实现便携的，实时现场的检测。更重要的是，结合 电化学信号读出方法与各种行之有效的信号放大策略，可以得到高灵敏度、高特异性、高效 的亲和性电化学生物传感器用于检测疾病标志物。 为了提高电化学生物传感器检测的灵敏度，基于DNA扩增技术的信号放大策略引 起了人们研究的兴趣，包括聚合酶链反应(PCR)，链替代扩增反应(SDA)，环介导等温扩增法 (LAMP)，杂交连锁反应(HCR)和滚环扩增技术(RCA)。在这些DNA扩增技术中，RCA是一个简单 而强大的等温酶促过程，短的DNA或RNA引物在环状DNA模板和独特的DNA和RNA聚合酶的协 助下发生链延伸，形成单链的DNA或RNA长链。由于快速、高效和特异性好等优点，RCA在众多 分析应用中被广泛用于信号放大，如核酸、小分子、蛋白质、和病变细胞的检测，检测的目标 甚至可以在aM浓度级别。RCA产物包含成千上万的串联重复序列，它们和环形模板是互补 的。把这些串联重复序列转换成可检测电信号的读出方法对于实现各种分析目的是至关重 要的。最常见的读出RCA产物的方法是与连有指示剂的互补寡核苷酸短链进行杂交，指示剂 有荧光团，纳米粒子，量子点，联吡啶钌和酶等。相比之下，这种杂交方法涉及冗杂和耗时的 过程，而另一种利用DNA插入分子的方法表现出相当大的便捷性，已被广泛用于读取RCA产 物，插入分子包括亚甲基蓝，焚光染料，N-甲基Π 卜啉二丙酸IX，银纳米粒子等。最近，一种以DNA为模板合成的金属纳米颗粒作为DNA信号标记物出现，由于其毒 性低，生物相容性好，光学特性优良，以及DNA识别和信号放大的集成策略的易实现，在生物 分析方面吸引了越来越浓的兴趣。例如，富含胞嘧啶的DNA可以作为一种有效的制备银纳米 团簇颗粒的模板，这已广泛用于核酸、小分子、蛋白质、和癌细胞的检测。除了 DNA模板化的 银纳米团簇颗粒以外，DNA模板化的铜纳米团簇颗粒，包括随机双链DNA模板化的铜纳米团 簇颗粒和聚胸腺嘧啶模板化的铜纳米团簇颗粒，在生物传感方面已经吸引了越来越多的关 注。以DNA为模板合成CuNPs可以在反应开始后几分钟内完成，比其他DNA模板化金属纳米颗 粒的合成更快、更方便。高效、简单和快速的合成工艺使DNA模板化CuNPs在各种生物分析应 用方面具有广阔前景。双链DNA模板化的CuNPs已经被用于检测小分子，酶活性，核酸和金属 离子，并且结合HCR或RCA等DNA扩增技术能实现高灵敏度检测。与双链DNA模板化的CuNPs相 比较，以聚胸腺嘧啶为模板合成的CuNPs在生物分析中的应用还处于非常初期的阶段。特别 的是，以聚胸腺嘧啶为模板合成的CuNPs可以在没有链杂交的情况下合成，也就是说，只有 包含超过15个连续胸腺嘧啶的单链的序列能引起明显的CuNPs形成，这是非常简单和明确 的。此外，CuNPs的产率与以聚胸腺嘧啶的长度和数量高度相关，所以与可编程DNA扩增技术 结合设计开发高选择性和灵敏度的生物传感器。众所周知，RCA可以有效地生成成千上万的 单链的串联重复序列，可以直接作为CuNPs形成的模板。由此我们可以想象，用CuNPs标记 RCA在生物分析应用上是一个完美的策略，兼具高灵敏度和选择性。 到目前为止，大多数基于DNA模板化的CuNPs分析方法基本上是荧光检测。然而，单 个的CuNPs荧光发射只能持续20分钟，然后光强迅速下降，这可能会大大阻碍其在长期监测 方面的应用。
技术实现思路
在本工作中，结合电化学方法在测定金属离子方面的优越性，利用电化学读取方 法可以克服这一缺陷。我们设计了基于CuNPs标记的RCA级联信号放大策略，以电化学信号 读取方式，对前列腺特异性抗原(PSA)模型目标分子进行了检测，如图1所示。引物-AuNPs-适配体/PSA/anti-PSA三明治结构的形成引发了 RCA反应及随后CuNPs的形成。用凝胶电泳 证实了RCA过程。通过透射电子显微镜(TEM)对以RCA产物为模板的CuNPs进行了表征。通过 微分脉冲溶出伏安法(DPSV)检测从CuNPs溶解释放的大量的铜离子，可以评估PSA目标物的 量。对可能会影响分析性能的实验条件进行了优化。建立了滴定曲线并确定了 PSA检测极 限。最后，利用所建立的方法测定了临床血清实际样品中PSA的含量。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 以滚环扩增反应产物为模板合成的铜纳米颗粒CuNPs在电化学检测癌症标志物中 的应用。 以滚环扩增反应产物为模板合成的铜纳米颗粒CuNPs在电化学生物分析中的应 用。以滚环扩增反应产物为模板合成的铜纳米颗粒CuNPs在电化学检测人类前列腺特 异性抗原PSA中的应用。 一种基于DNA模板化的CuNPs电化学检测癌症标志物的方法，包括如下步骤：构建能够与环状模板杂交并触发RCA反应的"primer-AuNP-aptamer/抗原/抗体" 三明治结构； 引发了RCA反应，形成一个包含连续多个胸腺嘧啶的串联重复序列单链DNA; 合成 CuNPs; 溶解上述CuNPs，以电化学方法检测Cu+含量； 根据Cu+与癌症标志物含量的对应关系，确定待测液中癌症标志物的含量。 优选的，所述"primer-AuNP-aptamer/抗原/抗体"三明治结构由primer-AuNP-aptamer生物共辄体与相应的抗体、抗原特异结合而成。 优选的，所述primer-AuNP-aptamer生物共辄体能够特异性识别相应的癌症抗原 或癌症标志物并且形成三明治夹心结构。 优选的，所述primer-AuNP-aptamer生物共辄体通过金纳米粒子AuNPs和DNA序列 间的Au-S键结合。优选的，所述金纳米粒子AuNP作为载体增加了引物/适体的比例，从而放大信号。 优选的，在T4连接酶和环状模板DNA存在的情况下，primer-AuNP-aptamer生物共 辄体中的引物可以与环状模板进行杂交并且在phi29DNA聚合酶的协助下进一步触发RCA反 应。本专利技术还提供了一种基于DNA模板化的CuNPs电化学检测人类人类前列腺特异性 抗原PSA的方法，包括如下步骤：构建能够与环状模板杂交并触发RCA反应的"引物primer-纳米金AuNP-适配体 aptamer/PSA/PSA 抗体 anti-PSA" 三明治结构；引发了RCA反应，形成一个包含连续多个胸腺嘧啶的串联重复序列单链DNA; 合成 CuNPs; 溶解上述CuNPs，以电化学方法检测Cu+含量。 优选的，所述"pr imer-AuNP-aptamer/抗原/抗体"三明治结构由primer-本文档来自技高网...
【技术保护点】
以滚环扩增反应产物为模板合成的铜纳米颗粒CuNPs在电化学检测癌症标志物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱烨，王慧娟，朱静，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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