提供一种分析样品的方法。在某些实施方案中，该方法可以包括：(a)使用多孔毛细管膜过滤含有滚环扩增(RCA)产物的液体样品，从而在膜上产生RCA产物的阵列；其中样品含有至少第一RCA产物群体和第二RCA产物群体，其中将标记的RCA产物的第一和第二群体可区分地标记；以及(b)测定膜的区域中第一标记的RCA产物群体的量和第二标记的RCA产物群体的量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用本申请要求2015年4月30日提交的英国专利申请系列号1507376.0的权益，在本文中并入所述申请用于全部目的。背景使用母体血液样品或非侵入地从孕妇获得的另一种样品，非侵入产前检验提供了胎儿状况或健康的信息。早期检测胎儿状况或健康允许定向干预和医学治疗。滚环扩增(RCA)可用于分析母体血液中的无细胞DNA。但是，在统计稳健性情况下对RCA产物定量可能有挑战性。在实践层面，尽管RCA反应中产物的绝对数目可能足够高以提供统计稳健性，但反应中特异性RCA扩增子摩尔浓度的可能相当低，这限制了可以用来定量这些扩增子的方法类型。例如，理论上可以通过以下方式检测到样品中的RCA产物：将RCA产物标记，将样品沉积到载玻片表面上，以及计数载波片上标记产物的数目。但是，单纯在载玻片上放置含有标记的RCA产物的溶液、允许标记的RCA产物扩散到表面上并且随后计数已经附着至载玻片的标记的RCA产物的数目耗费几小时，并且并不是全部标记的RCA产物均抵达载波片并被计数。本文描述了过滤到固相支持物上以对标记的RCA产物定量的应用。如下文将更详细地描述，该方法可以促进含有RCA产物的样品的分析。概述提供一种分析样品的方法。在某些实施方案中，该方法可以包括：(a)使用多孔毛细管膜过滤含有滚环扩增(RCA)产物的液体样品，从而在膜上产生RCA产物的阵列；其中样品含有至少第一RCA产物群体和第二RCA产物群体，其中将标记的RCA产物的第一和第二群体可区分地标记；以及(b)测定膜的区域中第一标记的RCA产物群体的量和第二标记的RCA产物群体的量。在一些实施方案中，测定步骤可以包括计数该区域内第一和第二标记的RCA产物的数目。在其他实施方案中，测定步骤可以包括检测来自该区域的集合信号。采用任一种方式，该方法可以提供样品中第一和第二RCA产物群体的数目的估计量。取决于该方法如何实施，多孔毛细管膜的使用可以使得定量样品中基本上全部的RCA产物(不仅仅是碰巧扩散到载玻片表面的那些)成为可能，并且这转而增加测定的精度、灵敏度和重现性。另外，与一些备选方法相比，多孔毛细管膜的使用允许在数分钟内而非数小时完成测定，如上文所示，所述备选方法可能依赖于将样品抽吸到载玻片上并且随后将载波片温育延长的时间段，以希望RCA产物将会扩散并粘附于载波片表面。与此一致，本申请的实验部分报告，如与载玻片上16小时温育相比，本专利技术方法的实施可以导致在90秒(这等于在膜顶部放置样品并且随后抽吸样品穿过膜所耗费的时间)后计数至少2.5倍的RCA产物。此外，膜的使用可以通过使得潜在背景源(例如，尚未与RCA产物杂交的荧光寡核苷酸分子等)穿过膜，减少背景(尤其如果在已经施加RCA产物后洗涤膜的情况下)。因为如上文提到，膜起到在膜表面上浓缩RCA产物的作用，所以该方法特别用于分析RCA产物的浓度范围相对广泛(例如，50μl至200μl或更大体积内10个至1千万个RCA产物)的样品，所述RCA产物在许多情况下可能具有相对低的浓度。换句话说，在不使用膜的情况下并代之使用替代性方案，50μl样品将扩散遍及玻璃显微镜载玻片表面并且即使可以引起全部RCA产物与载片结合，RCA产物将在载片上相互空间分离，从而单个视野将仅含有数目不足的RCA产物，从而使得通过显微术或其他手段以任何合理准确度定量这些RCA产物费时和低效。取决于如何实施该方法，膜可以起到以下作用：浓缩及支撑RCA产物的作用，与此同时，提供可以借以洗涤RCA产物以降低背景的手段。此外，膜可以充当显微术载片，尤其如果它是透明的或可以通过添加润湿剂令其透明的情况下。总之，认为本专利技术方法提供了一种测定样品中RCA产物的量的快速、高精确、灵敏和可重现方式–所述RCA产物是本身已经按如此意义无偏倚产生，从而每种靶分子由仅一种RCA产物代表(与其中将每个靶分子扩增到未知数目的副本和不同靶分子按不同量扩增的PCR相反)的产物。从而，本专利技术方法应当证明对快速、精确和准确测量样品中DNA分子丰度不可或缺的应用而言是非常宝贵的。尤其，本专利技术方法应当证明对非侵入性产前检验是有价值的，其中快速、精确和准确测量母体血流的无细胞级分中相对低浓度的DNA分子的丰度至关重要。这些及其他潜在特征和优点可以基于以下描述变得显见。附图简述技术人员将会理解，下文描述附图仅用于说明目的。附图不意在以任何方式限制本专利技术教导内容的范围。图1示意性地显示本专利技术方法的一些步骤。图2示意性地显示本专利技术方法的一些原理。图3是在y-轴上描述每图像的计数值和在x-轴中描述样品、温育时间和玻璃或氧化铝平板类型的图。图4是显示实施例2中描述的实验的一些结果的直方图。图5是两个通道的计数之间的比率相对于细胞系混合物组成的曲线。专利技术详述在描述多种实施方案之前，应当理解本公开的教导内容不限于所述的具体实施方案，并且本身当然可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，因为本专利技术教导内容的范围将仅由所附的权利要求限制。本文所用的章节标题仅出于组织目的并且不得以任何方式解释为限制所描述的主题。尽管结合多种实施方案描述了本专利技术教导内容，本专利技术的教导内容不意图限于这类实施方案。相反，本专利技术教导内容涵盖各种备选物、修饰和等同物，如本领域技术人员将领会。除非另外定义，本文中所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料也可以用于本专利技术教导内容的实施或检验，然而现在描述一些示例性方法和材料。对任何出版物的引用是因其在申请日前的披露并且不应当解释为承认因在先专利技术而不认为本专利技术权利要求早于这种出版物。此外，所提供的公开日可能不同于需要独立核实的实际公开日。如本领域技术人员阅读本公开时将显而易见，本文所描述和展示的各个变型的每一者都具有可以容易地与其他几种实施方案的任一者的特征分离或与之组合的独立组分和特征，而不脱离本专利技术教导内容的范围或精神。任何所述的方法可以按列举的事件顺序或按逻辑上可能的任何其他顺序实施。本文提到的全部专利和出版物，包括这些专利和出版物内公开的所有序列在内，均明确地通过引用的方式并入。在更详细地描述示例性实施方案之前，阐述以下含义以显示说明书中所用术语的含义和范围。必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(an)”包括复数称谓。例如，术语“引物”指一种或多种引物，即，单一引物和多重引物。进一步指出，可以起草这些权利要求以排除任何任选的要素。因而，这种声明意在充当与描述权利要求要素相联系地使用这类排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定式”限制的先行基础。如本文所用，术语“过滤”包括通过滤器移除含有分析物(例如，滚环扩增产物)的液体，从而一些分析物被滤器留下的动作。在过滤时，至少一些液体从滤器的一侧转移到另一侧。如本文所用，术语“滚环扩增”或“RCA”包括使用链置换聚合酶产生环状核酸模板线性连环化副本的等温扩增。RCA是分子生物学领域中熟知的并且在多种出版物中描述，包括但不限于Lizardi等人(Nat.Genet.199819:225-232)、Schweitzer等人本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分析样品的方法，包括：(a)使用多孔毛细管膜过滤含有滚环扩增(RCA)产物的液体样品，从而在膜上产生RCA产物的阵列；其中样品含有至少第一RCA产物群体和第二RCA产物群体，其中将标记的RCA产物的第一和第二群体可区分地标记；以及(b)测定膜的区域中第一标记的RCA产物群体的量和第二标记的RCA产物群体的量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.30 GB 1507376.01.一种分析样品的方法，包括：(a)使用多孔毛细管膜过滤含有滚环扩增(RCA)产物的液体样品，从而在膜上产生RCA产物的阵列；其中样品含有至少第一RCA产物群体和第二RCA产物群体，其中将标记的RCA产物的第一和第二群体可区分地标记；以及(b)测定膜的区域中第一标记的RCA产物群体的量和第二标记的RCA产物群体的量。2.根据权利要求1所述的方法，其中测定步骤(b)包括计数该区域内第一和第二标记的RCA产物的数目。3.根据权利要求1所述的方法，其中测定步骤(b)包括检测来自该区域的集合信号。4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中多孔毛细管膜是多孔阳极氧化铝膜。5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前，通过使荧光标记的寡核苷酸与RCA产物杂交可区分地标记RCA产物。6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法包括对膜的一个区域成像以产生一幅或多幅图像并测定所述一幅或多幅图像中各个标记的RCA产物的数目。7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中通过以下方式进行步骤(a)：(i)在多孔毛细管膜上放置样品；以及(ii)施加使样品移动穿过所述膜的力。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述力是主动力或被动力。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述主动力是离心力、负压或正压。10.根据权利要求8所述的方法，其中通过毛细管作用或蒸发施加被动力。11.根据前述权利要求任一项所述的方法，还包括在步骤(a)和(b)之间洗涤多孔毛细管膜。12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中计数步骤包括计数膜的所述区域中至少1,000个标记的RCA产物。13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中膜中孔的内径处于2nm至500nm范围内。14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中膜中相邻孔的中心之间的平均距离处于50nm至1000nm范围内。15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中膜中相邻孔的边缘之间的平均距离处于10nm至500nm范围内。16.根据前述权利要求任一项所述的方法，还包括将样品中第一RCA产物的量与样品中第二RCA产物的数目比较。17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤(a)和(b)之间使用润湿剂使多孔毛细管膜透明。18.一种分析样...
【专利技术属性】
技术研发人员：O·厄曼，F·佩尔松，M·豪厄尔，
申请(专利权)人：苏州新波生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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