具有高准确度的单分子分析制造技术

本发明专利技术涉及用于分析单分子、特别地用于单个核酸分子的测序的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】描述本专利技术涉及用于分析单分子，特别是用于单个核酸分子的测序的方法。对近3×109个碱基组成的人类基因组、或其它生物体的基因组的测序，以及单个序列变体的测定和比较需要提供测序方法，所述方法首先是快速的，其次可被常规且成本效益地应用。已作出巨大的努力来加速熟悉的测序方法(例如根据Sanger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74(1977),5463)的酶链终止法)，特别地通过自动化(Adams等，AutomatedDNASequencingandAnalysis(1994),NewYork,AcademicPress)。对具有成本效益的测序的高度需求已经驱动着平行测序方法从而同时产生多个序列的高通量测序技术的发展。这些测序技术的实例是大规模平行指纹测序(LynxTherapeutics)、聚合酶克隆(polony)测序(LifeTechnologies)、454焦磷酸测序(RocheDiagnostics)、Illumina测序(SolexaInc.)、连接法测序(LifeTechnologies)、离子洪流半导体测序(LifeTechnologies)或DNA纳米球测序(CompleteGenomics)。这些技术允许快速分析核酸群中的共有序列。然而，存在于待分析的核酸群中的少数序列中(例如少数细胞基因组中)的突变将不会被检测到，因为它们被存在于群中的大多数其它序列所掩盖(obscured)。另一个方法是单分子测序(等，Bioimaging5(1997),139-152)，其中通过荧光标记的单链DNA分子的渐进式酶促降解(progressiveenzymaticdegradation)和通过在微观结构通道中连续释放的单体分子的检测进行核酸的测序。该方法具有仅单分子靶核酸就足以进行序列测定的优点。PCT/EP01/07462公开了多重测序法(multiplexsequencingprocess)，其包括以固定的形式提供在载体上具有多个荧光标记基团的核酸分子，和基于所述核酸分子和/或切掉的核苷酸构件块的时间依赖性荧光变化(当所述核苷酸构件块被切掉时引起的)同时测定多个核酸分子的碱基序列。根据WO2003/052137，通过将光照射至载体上，并通过固定的核酸分子区域中的载体表面上的内反射产生倏逝激发场来测定序列。WO2006/013110描述了多重测序法，其包括以固定的形式提供核酸降解和/或核酸合成酶分子，将固定的酶与游离核酸分子接触，以及基于时间依赖性荧光变化(当核酸构件块被掺入核酸分子和/或从核酸分子切掉时引起的)同时测定多个核酸分子的碱基序列。WO2013/131888公开了用于核酸分子(特别地在单个分子中)的平行高通量测序的方法，所述方法涉及环状核酸模板分子的使用。最近，已开发了用于测定单个DNA链的序列的单分子测序技术，例如heliscope单分子测序(HelicosBiosciences)或单分子实时测序(PacificBioscience)。目前的商业单分子DNA测序技术的方法涉及DNA序列的所谓的共有序列测定(consensusdetermination)。这意味着其意欲通过分析若干相似DNA片段和通过使用复杂性统计算法(complexstatisticalalgorithms)评估正确的DNA序列来提供DNA片段序列的准确测定(优选99.9％或更好)。这些算法基于在待分析的样品中只存在单个序列的假定。因此，如果在样品中存在与所述样品中另外的DNA分子区别在于它们的序列的少数序列变体，则这样的少数序列变体将不会被考虑，而是会通过算法被处理为“噪声”或“误差”。如果样品含有浓度大致相同的不同DNA序列变体的混合物，则基于算法的分析将不能得出“共有”序列并且结果将作废(无效)。然而复杂性算法的使用是补偿目前的商购可得的单分子DNA测序技术只具有约85-90％的低初始准确度(primaryaccuracy)所必需的。为了克服与现有测序方法相关的准确度问题，本专利技术提供了获得足够的精密度以允许分析单个链突变以及它们在DNA分子群中的分布的单分子测序方法。因此，本专利技术提供了用于分析单分子，特别地用于分析多个单分子，更特别地用于对单个核酸分子进行测序的方法和设备，所述方法和设备包括以特性：-载体，其具有至少一个样品点以用于将待分析的单分子放置在载体上，-光源，特别是多点式激光，其在载体上的至少一个单分子的位置上提供至少一个照射体积元(illuminatedvolumeelement)，例如共聚焦体积元，和-检测器，特别是多像素检测器，其允许从载体上的单个单分子进行单光子检测。通过光源、载体和检测器之间的光学路径，检测器上(即图像平面中)的检测像素被光学投影至载体上，即至物体平面上。由此，图像平面中的检测像素的尺寸相较于检测像素在载体上的光学投影的尺寸被放大，例如10-200倍，优选40-120倍。根据本专利技术，将载体上的样品点与单个检测像素的光学投影、优选与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。样品点的中心与像素投影中心之间的对齐优选被以例如5nm或更小，2nm或更小或甚至1nm或更小的公差(tolerance)提供。可通过衍射光学元件和/或调整元件来提供对齐。这样将样品点定位在载体上以及这样将像素光学投影在载体上以使得载体上的单个样品点之间的距离优选等于像素在载体上的光学投影之间的距离。由此，来自单个检测器像素的信息之间的串扰被避免，并且可通过单次测量和任选地多达10次，例如1、2、3、4或5次测量重复，以高准确度，优选以至少99.0％、至少99.3％、至少99.6％或至少99.9％的准确度分析单个单分子。本专利技术的进行DNA测序的方法是具有优选至少99.9％的初始准确度的单分子DNA测序的方法。由于该方法是高度准确的，因此每一个单个DNA分子的序列被正确读取，并且无需超过可能数次例如1、2或3次重复的每一个单个DNA分子的测量来获得几乎100％的准确度。“共有”序列的概念不适用于本DNA测序，并且不需要复杂性算法来解释测量数据。假如初始准确度(即单碱基的成功鉴定的概率)为p(0<p<1)，则当对长度为N个碱基对的DNA片段测序时以ε(0<ε<1)的准确度获得测序结果所需的测序轮的平均轮数为在下文表1中，方程式(1)用于计算长度分别为100个碱基对和1000个碱基对的DNA片段的所需测序轮数。表1:本技术对比其它DNA单分子测序技术的比较概述获得准确读出所需的重新测序轮数的计算(方程式1的推导)定义p为初始准确度＝单碱基的成功鉴定的概率。p是定义在0至1的闭区间中的实值数。N为待测序的DNA分子中的碱基数。N为正整数。pseq为N个碱基的完整序列被正确读取的概率。pseq为定义在0至1的闭区间中的实值数。则：pseq＝pN(2)。定义r为该方法将从给定的DNA分子分析和读出DNA序列的次数。R为正整数。R还可被称为“重新测序轮数”。那么每r轮进行的测序中至少一个读出将是正确的概率ε通过下面的方程式给出:ε为0与1之间的闭区间中的实值数。在方程式(3)中的插入方程式(2)得到ε＝1–(1–pN)r，其等于1-ε＝(1–pN)r(4)。此外，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分析单分子的方法，其包括以下步骤：(a)提供至少一个定位在载体上的单个样品点上的待分析的单分子，其中所述点具有在约1‑20nm的范围内的直径，并且每一个单个点之间的距离为所述点的直径的至少约10倍，优选约20‑500倍，(b)用光源单个地照射单个样品点上的单分子，其中所述光源在样品点处提供至少一个照射体积元，(c)利用包含至少一个检测像素的光检测器单个地检测来自所述单分子的光，其中检测器上的所述检测像素具有在约0.5μm‑50μm的范围内的直径，并且每一个检测像素之间的距离为检测像素的直径的至少约2倍，优选约3‑10倍，以及(d)使来自单个检测像素的检测光与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，其中检测像素在载体上的光学投影具有在约100nm‑5μm的范围内的直径，并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影，特别地与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.10 EP 14150807.71.一种用于分析单分子的方法，其包括以下步骤：(a)提供至少一个定位在载体上的单个样品点上的待分析的单分子，其中所述点具有在约1-20nm的范围内的直径，并且每一个单个点之间的距离为所述点的直径的至少约10倍，优选约20-500倍，(b)用光源单个地照射单个样品点上的单分子，其中所述光源在样品点处提供至少一个照射体积元，(c)利用包含至少一个检测像素的光检测器单个地检测来自所述单分子的光，其中检测器上的所述检测像素具有在约0.5μm-50μm的范围内的直径，并且每一个检测像素之间的距离为检测像素的直径的至少约2倍，优选约3-10倍，以及(d)使来自单个检测像素的检测光与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，其中检测像素在载体上的光学投影具有在约100nm-5μm的范围内的直径，并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影，特别地与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。2.一种用于分析单分子的方法，其包括以下步骤：(a)提供多个待分析的单分子，每一个单分子被定位在载体上的单个样品点处，其中所述点具有在约1-20nm的范围内的直径，并且单个点之间的距离为所述点的直径的至少约10倍，优选约20-500倍，(b)用光源单个地照射单个样品点上的单分子，其中所述光源在样品点处提供多个单个的照射体积元，(c)利用光检测器单个地检测从所述单分子发射的光，其中所述光检测器包含多个检测像素，其中检测器上的所述检测像素具有在约0.5μm-50μm的范围内的直径，并且所述检测像素之间的距离为检测像素的直径的至少约2倍，优选约3-10倍，以及(d)使来自单个检测像素的检测光与定位在单个点上的单分子相关的事件相关联，其中检测像素在载体上的光学投影具有在约100nm-5μm的范围内的直径，并且其中将单个样品点与单个检测像素在载体上的投影，特别地与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。3.权利要求1或2的方法，其中以≤5nm、≤2nm或≤1nm的位置准确度将单个样品点中心与单个检测像素在载体上的投影中心对齐。4.权利要求1-3的任一项的方法，其中载体上的单个样品点之间的距离等于检测像素在载体上的光学投影之间的距离。5.权利要求1-4的任一项的方法，其中从任选地可检测的标记基团，特别地从荧光标记基团发射检测光。6.权利要求1-5的任一项的方法，所述方法用于对单个核酸分子进行测序，特别地用于对多个单个核酸分子进行平行测序。7.权利要求1-6的任一项的方法，其包括以下步骤：-在载体的单个样品点处提供(i)单个核酸分子，(ii)核酸合成酶分子和/或核酸降解酶分子，和(iii)以游离形式存在的和/或掺入核酸分子中的荧光标记的核苷酸构件块，-进行酶促反应，其中将核苷酸构件块掺入所述单个核酸分子中和/或从其切掉，以及-基于当核苷酸构件块被掺入所述单个核酸分子和/或从其切掉时引起的时间依赖性荧光变化，单个地测定核酸分子的碱基序列。8.权利要求6或7的方法，其中单个核酸分子是环状的，或其中单个核酸分子是线性的。9.权利要求7-8的任一项的方法，其中核酸合成酶分子和/或核酸降解酶分子以固定的形式存在。10.权利要求7-8的任一项的方法，其中核酸分子以固定的形式存在。11.权利要求1-10的任一项的方法，其中载体具有平坦表面。12.权利要求1-11的任一项的方法，其中载体具有选自玻璃、塑料、金属、石英、半金属、金属氧化物或包含多种所述材料的复合材料的表面。13.权利要求1-12的任一项的方法，其中样品点包含载体上的涂覆的表面区域或沉积在载体的表面上的颗粒。14.权利要求1-13的任一项的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·里吉勒，L·埃德曼，
申请(专利权)人：格诺特斯控股股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH