大肠杆菌的检测方法、以及大肠杆菌检测用载体技术

本发明专利技术提供一种能够同时并且以高特异性进行包括不具有病原性的大肠杆菌在内的大肠杆菌、和成为食物中毒的原因的肠道出血性大肠杆菌的检测的大肠杆菌的检测方法。本发明专利技术是同时地检测肠道出血性大肠杆菌及大肠杆菌(包括肠道出血性大肠杆菌)的大肠杆菌的检测方法，以从试样中提取的基因组DNA作为模板，利用多重PCR使大肠杆菌的包含尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)的DNA片段、包含Vero毒素1型基因(vtx1)的DNA片段、和包含Vero毒素2型基因(vtx2)的DNA片段同时扩增，检测各自的扩增产物的有无，由此同时地检测试样中的肠道出血性大肠杆菌的有无及大肠杆菌的有无。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于检测食物中毒菌等微生物的技术，特别涉及大肠杆菌的检测方法、以及大肠杆菌检测用载体。
技术介绍
近年来，虽然随着食品、环境等公共卫生的领域的卫生水平的提高，在食物中毒的发生方面可以看到减少的趋势，然而目前在日本国内仍然每年有2万人以上罹患食物中毒。其中，包含不少以肠道出血性大肠杆菌等病原性的大肠杆菌为原因的食物中毒，为了防止该食物中毒的发生，在食物中毒菌等的检查中，重要的是高精度地检测食品、环境中的病原性大肠杆菌。作为检测病原性大肠杆菌的方法，例如如专利文献1、2中记载所示，有如下的方法，即，使用能够扩增Vero毒素基因的引物，利用PCR(聚合酶链式反应)法扩增包含该基因的DNA片段，通过利用电泳法分析其扩增产物的尺寸来进行。另外，如本申请人的专利文献3中记载的专利技术所示，还有使用固定化有与PCR的扩增产物互补地结合的探针的DNA芯片来进行病原性大肠杆菌等的检测的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第2905945号公报专利文献2：日本专利第2775663号公报专利文献3：国际公开第2011/142119号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的问题但是，在公共卫生的领域中，希望不仅可以检查成为食物中毒的原因的病原性大肠杆菌的有无，还可以作为粪便污染等卫生学的指标，无论是否病原性，都可以同时地检测大肠杆菌的有无。然而，上述的以往的技术中，无法与病原性大肠杆菌同时地检测包括不具有病原性的大肠杆菌在内的大肠杆菌。另外，在进行大肠杆菌检查的实际的现场，由于在检查试样中混入食物的基因等各种DNA，因此要求特异性优异的检测精度。本专利技术是鉴于上述情况而完成的，目的在于，提供能够同时地并且以高特异性进行包括不具有病原性的大肠杆菌在内的大肠杆菌、和成为食物中毒的原因的肠道出血性大肠杆菌的检测的大肠杆菌的检测方法、以及大肠杆菌检测用载体。用于解决问题的方法为了达成上述目的，本专利技术的大肠杆菌的检测方法采用了如下的方法，是同时地检测肠道出血性大肠杆菌及大肠杆菌(包括肠道出血性大肠杆菌)的大肠杆菌的检测方法，以从试样中提取的基因组DNA作为模板，利用多重PCR同时地扩增大肠杆菌的包含尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)的DNA片段、包含Vero毒素1型基因(vtx1)的DNA片段、和包含Vero毒素2型基因(vtx2)的DNA片段，检测各自的扩增产物的有无，由此同时地检测试样中的肠道出血性大肠杆菌的有无及大肠杆菌的有无。另外，本专利技术的大肠杆菌检测用载体采用了如下的构成，是用于同时地检测肠道出血性大肠杆菌及大肠杆菌(包括肠道出血性大肠杆菌)的大肠杆菌检测用载体，固定化有包含选自大肠杆菌的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)中的序列编号7～9所示的碱基序列的至少两个以上的探针、包含选自大肠杆菌的Vero毒素1型基因(vtx1)中的序列编号10～17所示的碱基序列的至少任意一个探针、和包含选自大肠杆菌的Vero毒素2型基因(vtx2)中的序列编号18～22所示的碱基序列的至少任意一个探针。专利技术效果根据本专利技术，能够同时地并且以高特异性进行包括不具有病原性的大肠杆菌在内的大肠杆菌、和成为食物中毒的原因的肠道出血性大肠杆菌的检测。附图说明图1是表示本专利技术的实施方式的大肠杆菌的检测方法及大肠杆菌检测用载体的试验1、3中所用的菌株的毒素基因拥有状况的图。图2是表示本专利技术的实施方式的大肠杆菌的检测方法中所用的3种引物对的碱基序列(引物序列)的图。图3是表示本专利技术的实施方式的大肠杆菌的检测方法的借助多重PCR得到的扩增产物的电泳的结果的图。图4是表示本专利技术的实施方式的大肠杆菌的检测方法的使用用于扩增尿苷单磷酸激酶基因区域的引物对(pyrH引物对)得到的验证菌种的PCR扩增产物的电泳的结果的图。图5是表示本专利技术的实施方式的大肠杆菌的检测方法及大肠杆菌检测用载体的借助选自尿苷单磷酸激酶基因区域中的各探针(pyrH探针)得到的验证菌种的检测结果(荧光强度，S/N比值)的图。图6是表示本专利技术的实施方式的大肠杆菌检测用载体的探针的碱基序列(探针序列)的图。图7是表示本专利技术的实施方式的大肠杆菌的检测方法及大肠杆菌检测用载体的借助各探针得到的大肠杆菌的检测结果(荧光强度)的图。具体实施方式以下，对本专利技术的实施方式的大肠杆菌的检测方法、以及大肠杆菌检测用载体进行详细说明。本实施方式的大肠杆菌的检测方法的特征在于，是同时地检测肠道出血性大肠杆菌及大肠杆菌(包括肠道出血性大肠杆菌)的大肠杆菌的检测方法，以从试样中提取的基因组DNA作为模板，利用多重PCR同时地扩增大肠杆菌的包含尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)的DNA片段、包含Vero毒素1型基因(vtx1)的DNA片段、和包含Vero毒素2型基因(vtx2)的DNA片段，检测各自的扩增产物的有无，由此同时地检测试样中的肠道出血性大肠杆菌的有无及大肠杆菌的有无。大肠杆菌(Escherichiacoli)是革兰氏阴性且通性厌氧性的杆菌。是肠道菌的一种，大多数的大肠杆菌不具有病原性，对人无害。但是，在公共卫生的领域中，作为卫生学的指标，优选无论有无此种病原性，都可以大范围地检测大肠杆菌。因而，本实施方式的大肠杆菌的检测方法中，以大肠杆菌的基因组DNA中共同地拥有的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)作为扩增对象区域(扩增对象基因区域、靶向基因区域)利用PCR法进行扩增，检测其扩增产物，由此能够检测试样中的包括具有病原性的大肠杆菌和不具有病原性的大肠杆菌在内的大肠杆菌的有无。另外，在大肠杆菌中，存在有引起腹痛、腹泻等的大肠杆菌，一般将它们称作病原性大肠杆菌。特别是，在以O157等闻名的肠道出血性大肠杆菌(EHEC，enterohemorrhagicE.coli)中，存在有作为产生毒素的基因具有Vero毒素1型基因(vtx1)和/或Vero毒素2型基因(vtx2)的大肠杆菌。具体而言，例如如图1所示，存在有已知Vero毒素基因的拥有状况的菌株。在后述的实施例中，使用这些菌株，同时地检测pyrH、vtx1、以及vtx2这3个基因。本实施方式的大肠杆菌的检测方法中，以上述的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)和Vero毒素基因(vtx1、vtx2)作为扩增对象区域利用PCR法同时地进行扩增，检测其扩增产物，由此可以同时地检测试样中的包括肠道出血性大肠杆菌在内的大肠杆菌的有无、和肠道出血性大肠杆菌的有无。由此，根据本实施方式的大肠杆菌的检测方法，对于大肠杆菌，能够同时地识别以往的方法中无法做到的卫生指标菌及食物中毒危害菌的2种指标。本实施方式的大肠杆菌的检测方法中，如图2所示，作为用于将大肠杆菌的尿苷单磷酸激酶基因(pyrH)区域利用PCR法扩增的引物对(pyrH引物对)，优选使用由包含序列编号1所示的碱基序列的引物(F：正向引物)、和包含序列编号2所示的碱基序列的引物(R：反向引物)构成的引物对。另外，作为用于将肠道出血性大肠杆菌的Vero毒素1型基因(vtx1)区域利用PCR法扩增的引物对(vtx1引物对)，优选使用由包含序列编号3所示的碱基序列的引物(F：正向引物)、和包含序列编号4所示的碱基序列的引物(R：反向引物)构成的引物对。另外，作为用于将肠道出血性大肠杆菌的Vero毒素2型基因(vtx2)区域利用PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌的检测方法，是同时地检测肠道出血性大肠杆菌及大肠杆菌的大肠杆菌的检测方法，其中，所述大肠杆菌包括肠道出血性大肠杆菌，以从试样中提取的基因组DNA作为模板，利用多重PCR使大肠杆菌的包含尿苷单磷酸激酶基因pyrH的DNA片段、包含Vero毒素1型基因vtx1的DNA片段、和包含Vero毒素2型基因vtx2的DNA片段同时扩增，检测各自的扩增产物的有无，由此同时地检测试样中的肠道出血性大肠杆菌的有无及大肠杆菌的有无。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.11 JP 2014-1209161.一种大肠杆菌的检测方法，是同时地检测肠道出血性大肠杆菌及大肠杆菌的大肠杆菌的检测方法，其中，所述大肠杆菌包括肠道出血性大肠杆菌，以从试样中提取的基因组DNA作为模板，利用多重PCR使大肠杆菌的包含尿苷单磷酸激酶基因pyrH的DNA片段、包含Vero毒素1型基因vtx1的DNA片段、和包含Vero毒素2型基因vtx2的DNA片段同时扩增，检测各自的扩增产物的有无，由此同时地检测试样中的肠道出血性大肠杆菌的有无及大肠杆菌的有无。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，使用固定化有与将所述包含pyrH的DNA片段扩增而得的扩增产物互补地结合的探针、与将所述包含vtx1的DNA片段扩增而得的扩增产物互补地结合的探针、以及与将所述包含vtx2的DNA片段扩增而得的扩增产物互补地结合的探针的大肠杆菌检测用载体，同时地检测所述各自的扩增产物的有无。3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌的检测方法，其特征在于，使用含有由用于将所述包含pyrH的DNA片段扩增的包含序列编号1所示的碱基序列的引物和包含序列编号2所示的碱基序列的引物构成的引物对、由用于将所述包含vtx1的DNA片段扩增的包含序列编号3所示的碱基序列的引物和包含序列编号4所示的碱基序列的引物构成的引物对、以及由用于将所述包含vtx2的DNA片段扩增的包含序列编号5所示的碱基序列的引物和包含序列编号6所示的碱基序列的引物构成的引物对的PCR反应液，进行所述多重PCR，使用固定化有包含选自所述pyrH中的序列编号7～9所示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：中岛和辉，山崎隆明，古川聪史，
申请(专利权)人：东洋制罐集团控股株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP