本发明专利技术公开了一种耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法，构建了含有attI和attC重组位点且在attI和attC位点之间间隔440bpDNA序列的重组载体，载体精小，只有3270bp，可以同时进行切割attI和attC位点，也可以单独切开attC位点，载体本身还含有10多种多克隆位点，便于使用者选用适合的限制性内切酶来研究整合酶的作用位点，它带有氨苄抗性，便于筛选，可用于体外检测细菌耐药性整合酶整合活性的载体模型，也可以用来探索其他细菌整合子的整合机制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法。
技术介绍
在抗生素的选择压力下，细菌耐药菌株不断的增加，其中细菌通过基因的水平转移获得外源性耐药基因是细菌形成多重耐药的一种重要的途径。整合子-基因盒系统介导的细菌耐药机制因能解释耐药基因的快速传播而倍受关注。整合子可位于质粒、染色体或自身作为转座子的一个组成部分而参与转移，整合子由3个部分组成：5′保守末端、3′保守末端和两者之间的可变区。5′保守末端是整合子的基本结构，包括编码整合酶的基因(intI)、整合子重组位点attI和整合子可变区启动子(Pant)。IntI属于酪氨酸整合酶家族，催化基因盒在整合子重组位点attI和基因盒重组位点attC之间的整合和剪切。attC位点是一个不完全的反向重复序列，并含有一个可被整合酶识别的特异性整合位点。attC位点的长度为57～141bp，其最高度保守的特征是两个7bp的核心位点：核心位点GTTRRRY和与之相对称的反向核心位点RYYYAAC。可变区是插入编码某种功能的基因，如耐药基因，称为基因盒(genecassette)，目前发现了超过80多种包括抗生素耐药在内的基因盒。基因盒总是以5′-3′的方向整合入整合子，使其可以在上游启动子Pant的作用下得以表达。被捕获的基因盒5′端与整合酶的attI结合而3′端与attC发生特异性整合。2009年JuliaE等认为整合酶整合有两种机制。第1种：整合酶从整合子(供体)中切除的一个基因盒，形成一个共价闭环，然后它插入到另一整合子(受体)的attC位点；第2种：整合酶重组的供体和受体质粒，这些质粒都是由attI或者attC位点所形成的单一的共联体质粒，它们可由整合酶分成两个单独的质粒，一个质粒(受体)通过盒捕捉获得基因盒，另一质粒则失去，这两种机制它们所形成的最后的盒捕捉产物通过序列测定是没有区别的。2008年杨泽华博士做整合子捕获基因盒效率调控机制的研究，建立了测定整合子捕获基因盒效率的新方法。2010年魏取好博士做了细菌整合子捕获与表达耐药性基因盒调控机制的研究，建立了第1类整合子快速基因定位方法。基因治疗工具酶phiC31在体外整合活性方法已经建立，人类免疫缺陷病毒HIV-1整合酶体外活性检测方法也已建立，但是细菌耐药性整合酶体外活性测定方法还没有成功。细菌通过整合子系统的整合酶，捕获外来的耐药基因，使细菌具有耐药及多重耐药性，造成细菌多重耐药性的传播。研究表明大肠杆菌I型整合子的检出率呈上升趋势，细菌在整合子捕获基因盒的时候整合酶起着非常重要的作用，因此如果构建一个质粒载体模型，用来检测细菌耐药性整合酶体外整合的活性，可以为寻找抑制整合酶活性的方法打下基础。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法，该载体含有attI和attC重组位点且在attI和attC位点之间间隔440bpDNA序列的重组载体，可以用来研究耐药性大肠杆菌整合子捕获外来的耐药基因的过程、效率、机制。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法，包括如下步骤：S1、以440DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增，得440bpinsertion；F：CGGGATCCAGGGCGAGGAGCTGTTCACC；R：ACGCGTCGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTG；S2、以NCBI报道attI和attC序列为模板，设计特异性引物并加入和载体PUC19具有相同酶切位点和保护性碱基，利用PCR技术扩增整合酶基因重组位点attI和基因盒基因重组位点attC序列片段，然后将重组位点attI和attC序列克隆到载体PUC19上；S3、将步骤S1所得的PCR产物采用DNAGelExtractionKit进行纯化后和pUC19载体使用BamHISalI37℃酶切1h，酶切体系如下：PCR产物43μL、载体10μL、10Xbuffer5μL、10Xbuffer5μL、BamHI1μL、BamHI1μL、SalI1μL、SalI1μL、ddH2O33μL；S4、将所得的酶切产物采用DNAGelExtractionKit进行纯化后使用PromegaT4DNALigase室温连接2h，转化DH5alpha感受态，得耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC；连接体系如下；DNA片段3.5μL、载体1μL、T4DNALigase0.5Ml、10Xligasebuffer1μL。其中，所述步骤S1中的PCR反应体系为：10×PCRBuffer2.5μL；dNTP(2.5mM)1.6μL；primersF(5P)1μL；primersR(5P)1μL；Taq(5U/μL)0.125μL；ddH2016.775μL；DNA2μL。其中，所述attI通过以下特异性引物进行PCR扩增：F：AATTCtgatgttatggagcagcaacgatgttacgcagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaggcatcGAGCTR：CGATGCCTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAC。其中，所述attC通过以下特异性引物进行PCR扩增：F：GgcctaacccttccatcgagggggacgtccaagggctggcgcccttggccgcccctcatgtcaaacgttaggtAR；AGCTTACCTAACGTTTGACATGAGGGGCGGCCAAGGGCGCCAGCCCTTGGACGTCCCCCTCGATGGAAGGGTTAGGCCTGCA。其中，所述attI/attC片段使用以下体系退火：片段F(100μM)4.5μL；片段R(100μM)4.5μL；10Xannealingbuffer1μL。本专利技术具有以下有益效果：构建了含有attI和attC重组位点且在attI和attC位点之间间隔440bpDNA序列的重组载体，载体精小，只有3270bp，可以同时进行切割attI和attC位点，也可以单独切开attC位点，载体本身还含有10多本文档来自技高网...
【技术保护点】
耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19‑attl‑400‑attC的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、以440DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增，得440bp insertion；F：CGGGATCC AGGGCGAGGAGCTGTTCACC；R：ACGCGTCGAC GTTGTGGCTGTTGTAGTTG；S2、以NCBI报道attI和attC序列为模板，设计特异性引物并加入和载体PUC19具有相同酶切位点和保护性碱基，利用PCR技术扩增整合酶基因重组位点attI和基因盒基因重组位点attC序列片段，然后将重组位点attI和attC序列克隆到载体PUC19上；S3、将步骤S1所得的PCR产物采用DNA Gel Extraction Kit进行纯化后和pUC19载体使用BamHl Sall 37℃C酶切1h，酶切体系如下：PCR产物43μL、载体10μL、10X buffer 5μL、10X buffer 5μL、BamHl1μL、BamHl 1μL、Sall 1μL、Sall 1μL、ddH2O 33μL；S4、将所得的酶切产物采用DNA Gel Extraction Kit进行纯化后使用Promega T4DNA Ligase室温连接2h，转化DH5alpha感受态，得耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19‑attI‑400‑attC；连接体系如下；DNA片段3.5μL、载体1μL、T4 DNA Ligase 0.5MI、10X ligase buffer1μL。...
【技术特征摘要】
1.耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attl-400-attC的构建方法，
其特征在于，包括如下步骤：
S1、以440DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增，得440bpinsertion；
F：CGGGATCCAGGGCGAGGAGCTGTTCACC；
R：ACGCGTCGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTG；
S2、以NCBI报道attI和attC序列为模板，设计特异性引物并加入和载
体PUC19具有相同酶切位点和保护性碱基，利用PCR技术扩增整合酶基因重组
位点attI和基因盒基因重组位点attC序列片段，然后将重组位点attI和attC
序列克隆到载体PUC19上；
S3、将步骤S1所得的PCR产物采用DNAGelExtractionKit进行纯化
后和pUC19载体使用BamHlSall37℃C酶切1h，酶切体系如下：
PCR产物43μL、载体10μL、10Xbuffer5μL、10Xbuffer5μL、BamHl
1μL、BamHl1μL、Sall1μL、Sall1μL、ddH2O33μL；
S4、将所得的酶切产物采用DNAGelExtractionKit进行纯化后使用
PromegaT4DNALigase室温连接2h，转化DH5alpha感受态，得耐药性大肠
杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC；连接体系如下；
DNA片段3.5μL、载体1μL、T4DNALigase0.5MI、10Xligasebuffer
1μL。
2.根据权利要求1所述的耐药性大肠杆菌整合酶整合载体
pUC19-attI-400-attC的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中的PCR反应
体系为：
10×PCRBuffer2.5μL；dNTP(2.5mM)1.6μL；p...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾芳，杨江流，
申请(专利权)人：河套学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15
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