一种异源可溶性表达肝靶向干扰素的方法技术

本发明专利技术公开了一种异源可溶性表达肝靶向干扰素的方法，具体步骤为S1.将肝靶向干扰素突变成SEQ ID NO:2所示的突变肝靶向干扰素；S2.将编码SEQ ID NO:2所示突变肝靶向干扰素基因的核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子替换成大肠杆菌非稀有密码子，优化后的编码SEQ ID NO:2所示突变肝靶向干扰素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；S3构建表达突变肝靶向干扰素的重组表达载体，将重组表达载体导入大肠杆菌，获得可溶性表达突变肝靶向干扰素的重组大肠杆菌菌株，诱导重组大肠杆菌表达，获得可溶性表达的突变肝靶向干扰素。本发明专利技术首次实现了肝靶向干扰素的可溶性表达，表达产物无需变复性等复杂工艺即可获得高纯度目的蛋白，有助于减化制备工艺、降低生产成本；同时通过对肝靶向干扰素进行改造，获得生物学活性更强的突变肝靶向干扰素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种异源可溶性表达肝靶向干扰素的方法。
技术介绍
干扰素可通过多种途径发挥抗病毒和抗癌作用，但在应用时存在着用药剂量大、疗效不够理想、毒副作用大等缺点，限制了其在临床中的广泛应用。这主要原因是由于病毒性肝炎和肝癌的病灶主要在肝脏，治疗时干扰素在体内容易扩散降解，导致相对平均的组织分布，未能在肝脏形成有效的药物浓度。为了达到临床效果，药物剂量常要加大几倍、几十倍，药物剂量的加大也加重了其不良反应，又容易产生耐药性，从而影响疗效。将肝靶向肽CSPI-plus与干扰素（IFN）相融合，利用肝靶向肽CSPI-plus的肝靶向特性，使干扰素在肝脏富集，达到提高干扰素治疗肝脏疾病的特异性，减少用药量，降低毒副反应，具有良好的应用开发前景。但IFN-CSP是以包涵体的形式存在，需经过变性、复性等复杂制备过程才能获得有活性的蛋白，不仅工艺复杂、最终得率不高，且由于IFN-CSP分子结构中存在两对二硫键，复性过程中容易错误折叠，蛋白质复性效率不高，终产物的活性还有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的不足，提供一种异源可溶性表达肝靶向干扰素的方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种异源可溶性表达肝靶向干扰素的方法，包括如下步骤：S1.将肝靶向干扰素突变成SEQIDNO:2所示的突变肝靶向干扰素；S2.根据大肠杆菌的密码子偏好性，将编码SEQIDNO:2所示突变肝靶向干扰素基因的核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子替换成大肠杆菌非稀有密码子，优化后的编码SEQIDNO:2所示突变肝靶向干扰素的基因核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；S3构建表达突变肝靶向干扰素的重组表达载体，将重组表达载体导入大肠杆菌，获得可溶性表达突变肝靶向干扰素的重组大肠杆菌菌株，诱导重组大肠杆菌表达，获得可溶性表达的突变肝靶向干扰素。步骤S1中具体的突变策略为：从氨基端开始，将11位氨基酸由丝氨酸突变成天冬酰胺、14位氨基酸由苏氨酸突变成丙氨酸、16位氨基酸由甲硫氨酸突变成异亮氨酸、26位氨基酸由亮氨酸突变成脯氨酸、37和102位氨基酸由甘氨酸突变成谷氨酸、44位氨基酸由甘氨酸突变成天冬氨酸、在44和45位之间插入天冬氨酸，45位氨基酸由天冬酰胺突变成赖氨酸、51位氨基酸由谷氨酸突变成谷氨酰胺、52位氨基酸由苏氨酸突变成丙氨酸、54位氨基酸由脯氨酸突变成丝氨酸、68位氨基酸由丝氨酸突变成苏氨酸、79位氨基酸由苏氨酸突变成天冬氨酸、85位氨基酸由酪氨酸突变成半胱氨酸、100位氨基酸由异亮氨酸突变成甲硫氨酸、103位氨基酸由颉氨酸突变成谷氨酸、104位氨基酸由甘氨酸突变成精氨酸、106位氨基酸由苏氨酸突变成甘氨酸、112位氨基酸由赖氨酸突变成天冬酰胺、113位氨基酸由谷氨酸突变成丙氨酸、120位氨基酸由精氨酸突变成赖氨酸、124位氨基酸由谷氨酰胺突变成精氨酸、131位氨基酸由赖氨酸突变成苏氨酸、151位氨基酸由苯丙氨酸突变成亮氨酸、160和163位氨基酸由丝氨酸突变成精氨酸。原始肝靶向干扰素的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，突变肝靶向干扰素的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，突变的肝靶向干扰素的编码基因密码子未优化前的序列如SEQIDNO:3所示，突变的肝靶向干扰素的编码基因经大肠杆菌密码子优化后的序列如SEQIDNO:4所示。步骤S2中进行密码子优化的时候，具体为将原始核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子精氨酸（AGG、CGA、AGA）、亮氨酸（CTA）、异亮氨酸（ATA）和脯氨酸（CCC）分别替换为大肠杆菌高效表达基因常用密码子精氨酸（CGT）、亮氨酸（CTT）、异亮氨酸（ATT）和脯氨酸（CCA）。优选地，步骤S3所述纯化的具体步骤为：将重组大肠杆菌菌体超声破碎，超声破碎条件为冰浴条件下，每次50ml，功率40%，破碎2S，停2S，共30min；所得超声破碎后的菌体在8000rpm，4℃条件下离心30min，取其上清用0.45um的微孔滤膜过滤，过Ni柱，50mM咪唑和50mMTris-Hcl平衡，50mM咪唑和50mMTris-Hcl洗去杂蛋白，再用100mM咪唑和50mMTris-Hcl洗去杂蛋白，最后用500mM咪唑和50mMTris-Hcl洗脱缓冲液收集洗脱的目的蛋白，收集的洗脱液用超滤离心管进行超滤离心浓缩。优选地，步骤S3所述构建表达突变肝靶向干扰素的重组表达载体的步骤为：在目的载体的多克隆位点插入SEQIDNO:4所述编码基因。更优选地，所述目的载体为表达载体pET21b。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：传统的肝靶向干扰素均以包涵体的形式存在，需经过变性、复性等复杂制备过程才能获得有活性的蛋白，不仅工艺复杂、最终得率不高，且由于原始肝靶向干扰素分子结构中存在两对二硫键，复性过程中容易错误折叠，蛋白质复性效率不高，终产物的活性还有待进一步提高。本专利技术通过对原始肝靶向干扰素氨基酸序列进行分子改造，并在此基础上对其编码基因的核苷酸序列中密码子进行优化，首次实现了肝靶向干扰素的可溶性表达，表达产物无需变复性等复杂工艺即可获得高纯度目的蛋白，有助于减化制备工艺、降低生产成本；同时通过对肝靶向干扰素进行改造，获得生物学活性更强的突变肝靶向干扰素。本专利技术重组突变肝靶向干扰素的活性为1×109IU/mg，显著高于原始肝靶向干扰素的活性（1.2×108IU/mg）。重组突变肝靶向干扰素每4000万IU中的内毒素含量小于0.25EU，远低于中国药典中规定的每300万IU应小于10EU。而且，重组突变肝靶向干扰素的活性明显强于普通重组突变干扰素。附图说明图1为原始肝靶向干扰素与突变肝靶向干扰素氨基酸序列比对结果。图2为原始肝靶向干扰素与突变肝靶向干扰素的结构比对。图3为原始肝靶向干扰素与突变肝靶向干扰素的稳定性分析。图4突变肝靶向干扰素核苷酸序列大肠杆菌稀有密码子分析结果。图5突变肝靶向干扰素核苷酸序列密码子优化结果。图6突变肝靶向干扰素融合基因构建方法。图7为突变肝靶向干扰素融合基因的重组，其中，M为DNA分子量标准，1～8为第一次SOE-PCR扩增产物，9～12为第二次SOE-PCR扩增产物，13为重组的突变肝靶向干扰素全长基因。图8为重组克隆质粒的菌落PCR和双酶切鉴定，其中，M为DNA分子量标准，1为重组质粒的PCR鉴定；2为NdeI、XholI双酶切重组质粒。图9为突变肝靶向干扰素基因原核表达质粒构建示意图。图10为重组原核表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异源可溶性表达肝靶向干扰素的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将肝靶向干扰素突变成SEQ ID NO:2所示的突变肝靶向干扰素；S2.根据大肠杆菌的密码子偏好性，将编码SEQ ID NO:2所示突变肝靶向干扰素的基因核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子替换成大肠杆菌非稀有密码子，优化后的编码SEQ ID NO:2所示突变肝靶向干扰素的基因核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；S3构建表达突变肝靶向干扰素的重组表达载体，将重组表达载体导入大肠杆菌，获得可溶性表达突变肝靶向干扰素的重组大肠杆菌菌株，诱导重组大肠杆菌表达，纯化获得可溶性表达的突变肝靶向干扰素。

【技术特征摘要】
1.一种异源可溶性表达肝靶向干扰素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将肝靶向干扰素突变成SEQIDNO:2所示的突变肝靶向干扰素；
S2.根据大肠杆菌的密码子偏好性，将编码SEQIDNO:2所示突变肝靶向干扰素的基因
核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子替换成大肠杆菌非稀有密码子，优化后的编码SEQID
NO:2所示突变肝靶向干扰素的基因核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；
S3构建表达突变肝靶向干扰素的重组表达载体，将重组表达载体导入大肠杆菌，获得
可溶性表达突变肝靶向干扰素的重组大肠杆菌菌株，诱导重组大肠杆菌表达，纯化获得可
溶性表达的突变肝靶向干扰素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述诱导的条件为最适温度34℃、
菌体浓度OD600在0.4时再加入诱导剂、诱导剂IPTG的终浓度为0.4mML、诱导表达时间为6h。
3.根据权利要求1所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢雪梅，朱家勇，金小宝，
申请(专利权)人：广东药学院，
类型：发明
国别省市：广东;44