使用核酸条形码分析与单细胞缔合的核酸制造技术

本文提供使用核酸条形码来分析与单细胞缔合的核酸的方法和组合物。根据一些实施方案，一种用于制造一种或多种所关注的聚核苷酸的方法包括：获得多种与一种或多种样品缔合的RNA，其中所述样品获自一个或多个受试者，各RNA与单一样品缔合，并且与各样品缔合的RNA存在于独立反应容积中；添加衔接分子至与各样品缔合的RNA中，其中所述衔接分子使用酶反应产生并且包含通用引发序列、条形码序列和结合位点；以及将所述条形码序列并入一种或多种与各样品缔合的聚核苷酸中，由此制造所述一种或多种所关注的聚核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求名称为“AnalysisofNucleicAcidsAssociatedwithSingleCellsusingNucleicAcidBarcodes”并且在2013年12月30日提交的美国临时申请号61/922,012的权益，所述临时申请的完整内容出于所有目的以引用的方式并入本文。作为ASCII文本文件递交的“序列表”、表格或计算机程序列表附件的引用在2014年12月30日创建(18,227,200字节，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统)的文件97519-920777.txt中写出的序列表出于所有目的以引用的方式整体并入本文。在文件表18中写出的表18.[条形码_部分1].[条形码_部分1].txt,2,039,808字节；在文件表18中写出的表18.[条形码_部分2].[条形码_部分2].txt,90,112字节；在文件表22中写出的表22.[i5指数引物].[i5指数引物].txt,4,096字节；在文件表32中写出的表32.[孔-条形码].[孔-条形码].txt,4,096字节；在文件表32中写出的表32.[板-条形码].[板-条形码].txt,4,096字节(均在2014年12月24日创建，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统)出于所有目的以引用的方式整体并入本文。专利技术背景如免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因的可变基因由接合点之间具有P/N核苷酸添加的V(D)J基因区段的重排形成。完全功能Ig或TCR蛋白通过两种基因(对于Ig为重链和轻链基因，对于αβTCR为α和β基因并且对于γδTCR为γ和δ基因)的缔合形成。这种组合方法产生各种各样的不同的可能序列。这种谱系使免疫系统能够回应于生物体尚未遇到的新颖免疫损伤。免疫球蛋白基因还经历体细胞超突变，其进一步增加谱系大小。对应地，允许天然Ig或TCR蛋白的表达以研究其功能特性的对可变基因的任何核酸分析不仅需要对个别B(对于Ig基因)或T细胞(对于TCR基因)测序，而且需要构成蛋白的两种基因的天然配对。这可通过单细胞克隆和Sanger测序进行，但为缓慢并且费力的(参看例如Wrammert等人,Nature,2008,453:667-671)。已经开发了高通量方法来对天然配对基因进行高通量测序，并且分为两种方法。第一种方法是使独特核酸条形码识别符连接于来自细胞的核酸，并且如果基因共享所述相同条形码并且因此起源于相同细胞，那么经由使所述基因以生物信息学方式连接在一起来实现配对(PCT/US2012/000221)。第二种方法是使来自两种基因的核酸以物理方式连接在一起(参看例如美国专利号7,749,697)。所述第一种方法是优良的，因为其允许多种基因的配对(如鉴别特异性T细胞或B细胞子集的B或T细胞共同表达基因)，而所述第二种方法限于以物理方式连接一些核酸。迄今，实验数据仅关于其中已经以物理方式连接不超过两种核酸的情形存在。使核酸明确地缔合至单细胞(所述第一种方法)而非使其经由连接彼此缔合(所述第二种方法)具有优势。当核酸彼此缔合时，可难以区别PCR和测序误差与真实生物变异。必须关于测序平台的精确性进行假设并且读数基于百分比相似性截止值任意地被指定为不同序列，即具有>95％相似性的所有读数被指定为序列并且其间的任何差异均假定是归因于测序误差。这不能区别彼此非常相似的序列(参看Zhu等人,FrontiersinMicrobiology,2012,3:315)。此外，使用被指定为序列的读数的相对频率关于多少细胞共享所述同一序列进行假定。这是近似量度并且受到PCR扩增偏差影响，如本领域中众所周知。因此，使Ig或TCR核酸彼此缔合可仅产生近似值，而非进行测序的谱系的真实表示(参看Zhu等人,FrontiersinMicrobiology,2012,3:315)。然而，使用核酸条形码使核酸缔合至单细胞允许明确区别来自单B或T细胞的相似或甚至同一序列，因为各读数可被指定为细胞。此外，通过用所有与细胞缔合的读数创建共有序列，可获得非常精确并且几乎完全无误差序列并且可获得进行测序的谱系的精确表示。这也可普及至细胞中所有核酸的分析。另外，递送独特条形码至各单细胞的技术困难仍存在。连接核酸条形码至可变基因的目前最佳技术在水溶液中具有独特条形码并且各条形码甚至在连接条形码至可变基因核酸的反应之前存在于独立存储容器中(PCT/US2012/000221)，否则所述核酸条形码将在使用之前混合。这产生了对数千种细胞编条形码的逻辑困难，因为需要大量容器含有个别条形码。对于大量存储容器的需求也使这种方法与其中独特条形码无法个别地吸移至各个别反应容器(其也将含有单细胞)中的任一种方法不可相容。一个实例为纳升大小的反应容器，如纳米孔方法，其中将独特条形码个别地吸移至各纳米孔中为不切实际的，因为存在数千至数十万个纳米孔。这在其中使用油包水乳液产生液滴的纳米液滴方法中也是不可行的，因为数十万个纳米液滴仅由一些水流产生(参看例如DolomiteMicrofluidics或RaindanceTechnologies的产品)，并且在递送至纳米液滴之前不可能在个别存储容器中具有独特条形码。一种递送独特条形码至个别反应容器的方法是使用有限稀释来将独特条形码沉积于大多数反应容器中。可执行连接于可操纵物体(如珠粒)的条形码的有限稀释，所述可操纵物体各自具有所连接的一种特定条形码的多个拷贝，或可执行溶液中条形码的有限稀释。在稀释所述珠粒后，一种特定核酸条形码的多个拷贝存在于反应容器中，而在溶液中稀释条形码后，特定核酸条形码的仅单一拷贝存在于反应容器中。此外，添加核酸条形码至存在于反应容器中的所关注的样品源性核酸中将在所引入的条形码扩增以确保其足量存在于反应腔室中的情况下更完全。例如，典型哺乳动物细胞含有mRNA的大致400,000个拷贝。为了最大化总体单细胞分析的效率，应对尽可能多的这些mRNA拷贝编条形码。因此，至少特定核酸条形码的大致相同数目的拷贝，因为mRNA拷贝需要存在于反应容器中。溶液中条形码的有限稀释导致反应容器中仅有特定条形码的单一拷贝，而具有条形码的小(例如1-2μm直径)珠粒的稀释将预期提供最大数万个拷贝。因此，在任一情形中所述条形码的扩增均为重要的以在反应容器中产生足量的特定核酸条形码，使得所述条形码成功添加至最大数目的样品源性核酸中。然而，预期珠粒提供显著更多的起始物质并且因此提供显著更佳的条形码扩增。另外，充分大的珠粒可含有数十万个核酸条形码分子。在这种情形中，核酸条形码从所述珠粒裂解可足以在反应容器中产生足量的特定核酸条形码。此外，如果核酸连接于固体表面，那么其将不会如溶液中的核酸般自由地到处移动。对于核酸互补碱基配对，固相动力学比液相动力学慢得多，并且可使得条形码以低得多的效率添加至所关注的核酸中。优选地，核酸条形码应在参与条形码反应之前存在于液相中。本专利技术比先前专利技术(PCT/US2012/000221)在连接独特条形码至各样品方面有所改进，其中各样品通常为单细胞，但可普及至任何类型的样品。本专利技术使得独特条形码能够递送至任何类型的反应容器，并且还适用于纳升大小的反应容器并且不需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制造一种或多种所关注的聚核苷酸的方法，所述方法包括：获得多种与一种或多种样品缔合的RNA，其中所述样品获自一个或多个受试者，并且与样品缔合的所述RNA存在于独立反应容积中；添加衔接分子至与所述样品缔合的所述RNA中，其中所述衔接分子使用酶反应产生并且包含通用引发序列、条形码序列和结合位点；以及将所述条形码序列并入一种或多种与所述样品缔合的聚核苷酸中，由此制造所述一种或多种所关注的聚核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.30 US 61/922,0121.一种用于制造一种或多种所关注的聚核苷酸的方法，所述方法包括：获得多种与一种或多种样品缔合的RNA，其中所述样品获自一个或多个受试者，并且与样品缔合的所述RNA存在于独立反应容积中；添加衔接分子至与所述样品缔合的所述RNA中，其中所述衔接分子使用酶反应产生并且包含通用引发序列、条形码序列和结合位点；以及将所述条形码序列并入一种或多种与所述样品缔合的聚核苷酸中，由此制造所述一种或多种所关注的聚核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述酶反应产生所述衔接分子。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述衔接分子通过使模板分子与一种或多种酶接触而产生。4.如权利要求3所述的方法，其中所述模板分子为包含RNA聚合酶(RNAP)启动子的DNA分子，并且所述一种或多种酶包括RNA聚合酶。5.如权利要求4所述的方法，其中所述RNAP启动子选自由T7、T3和SP6组成的组。6.如权利要求3所述的方法，其中所述模板分子为包含切口核酸内切酶限制位点的DNA分子，并且所述一种或多种酶包括切口核酸内切酶和链置换DNA聚合酶。7.如权利要求6所述的方法，其中所述切口核酸内切酶限制位点选自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI组成的组。8.如权利要求6所述的方法，其中所述链置换DNA聚合酶选自由Klenowexo-、Bst大片段和Bst大片段的工程改造的变体组成的组。9.如权利要求3所述的方法，其中：所述模板分子结合于固体支撑物，所述固体支撑物与水溶液接触，并且所述衔接分子在其产生时释放至所述水溶液中。10.如权利要求9所述的方法，其中添加所述衔接分子至所述与一种样品缔合的RNA中包括组合所述水溶液与其中存在所述RNA的所述反应容积。11.如权利要求9所述的方法，其中所述水溶液与所述与一种样品缔合的RNA存在于相同反应容积中。12.如权利要求9所述的方法，其中：所述模板分子包含核酸内切酶限制位点，所述一种或多种酶包含限制核酸内切酶，并且所述衔接分子包含所述模板分子的一部分，所述部分在所述模板分子与所述限制核酸内切酶接触后产生并且释放至所述水溶液中。13.如权利要求9所述的方法，其中所述固体支撑物为珠粒或表面。14.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接分子在添加所述衔接分子至所述与一种样品缔合的RNA中之前以游离形式处于溶液中。15.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接分子在隔室中产生，并且添加所述衔接分子至所述与一种样品缔合的RNA中包括组合所述隔室与其中存在所述RNA的所述反应容积。16.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接分子在其中存在添加有所述衔接分子的所述RNA的所述反应容积中产生。17.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接分子未在其中存在添加有所述衔接分子的所述RNA的所述反应容积中产生。18.如权利要求1所述的方法，其中所述酶反应为等温反应。19.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接分子进一步包含独特分子识别符(UMI)序列。20.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接分子为RNA分子。21.如权利要求20所述的方法，其中所述衔接分子是使用RNAP产生。22.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接分子为DNA分子。23.如权利要求22所述的方法，其中所述衔接分子是使用DNAP产生。24.如权利要求22所述的方法，其中：制造所述一种或多种所关注的聚核苷酸包括反转录与所述样品缔合的所述RNA，由此合成多种第一链cDNA，与所述样品缔合的所述RNA中的至少一些包含与所述衔接分子的所述结合位点互补的序列区，并且所述衔接分子用作反转录的引物，使得所述条形码序列并入与所述样品缔合的第一链cDNA中。25.如权利要求24所述的方法，其中所述结合位点包含聚T区。26.如权利要求24所述的方法，其中所述结合位点包含随机区。27.如权利要求24所述的方法，其中所述结合位点出现于所述衔接分子的3’端。28.如权利要求24所述的方法，其中所述衔接分子在隔室中产生，并且反转录与所述样品缔合的所述RNA发生在组合所述隔室与其中存在所述RNA的所述反应容积后。29.如权利要求24所述的方法，其中反转录与所述样品缔合的所述RNA发生在其中产生添加至所述RNA中的所述衔接分子的相同反应容积中。30.如权利要求1所述的方法，其进一步包括反转录与所述样品缔合的所述RNA以获得多种cDNA，其中反转录RNA包括使用反转录酶和第一链引物合成cDNA的第一链。31.如权利要求30所述的方法，其中所述反转录酶为MMLVH-反转录酶。32.如权利要求30所述的方法，其中所述衔接分子在隔室中产生，并且添加所述衔接分子至所述与一种样品缔合的RNA中包括组合所述隔室与其中存在所述RNA的所述反应容积。33.如权利要求32所述的方法，其中cDNA的第一链在组合所述隔室与所述反应容积之前合成。34.如权利要求32所述的方法，其中cDNA的第一链在组合所述隔室与所述反应容积之后合成。35.如权利要求30所述的方法，其中反转录与所述样品缔合的所述RNA发生在其中产生添加至所述RNA中的所述衔接分子的相同反应容积中。36.如权利要求35所述的方法，其中所述反应容积中的缓冲液包含在pH8.0至pH8.8的pH范围内的Tris、钾离子、氯离子、硫酸根离子、铵离子、乙酸离子或镁离子中的至少一者。37.如权利要求30所述的方法，其中：所述反转录酶具有模板转换活性，与所述样品缔合的cDNA的至少一些第一链包含3’悬垂物，所述衔接分子的所述结合位点包含与所述3’悬垂物互补的3’部分，并且所述衔接分子用作所述反转录酶的模板，使得所述条形码序列并入与所述样品缔合的cDNA的第一链中。38.如权利要求37所述的方法，其中所述3’悬垂物包含一个或多个C核苷酸并且所述结合位点的所述3’部分包含一个或多个G核苷酸。39.如权利要求37所述的方法，其中所述第一链引物包含聚T区。40.如权利要求37所述的方法，其中所述第一链引物包含随机序列。41.如权利要求30所述的方法，其中制造所关注的聚核苷酸包括使用第一引物和第二引物扩增用于所述样品的cDNA的所述第一链，所述第二引物具有与所述第一链引物的至少一部分相同的序列，其中所述第一引物或所述第二引物为所述衔接分子。42.如权利要求41所述的方法，其中所述第一引物为所述衔接分子。43.如权利要求41所述的方法，其中所述第二引物为所述衔接分子。44.如权利要求41所述的方法，其中所述第一链引物包含聚T区。45.如权利要求41所述的方法，其中所述第一链引物包含随机序列。46.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含细胞。47.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞为血细胞、免疫细胞、组织细胞或肿瘤细胞。48.如权利要求47所述的方法，其中所述细胞为B细胞或T细胞。49.如权利要求46所述的方法，其中与所述样品缔合的所述RNA包含mRNA。50.如权利要求49所述的方法，其中与所述样品缔合的所述RNA包含至少1、3、10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000种mRNA。51.如权利要求49所述的方法，其中与所述样品缔合的所述RNA包含细胞的至少部分转录组。52.如权利要求46所述的方法，其中与所述样品缔合的所述RNA包含细胞的总RNA。53.如权利要求46所述的方法，其中每种样品制造至少10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000种所关注的聚核苷酸。54.如权利要求46所述的方法，其中所述一种或多种样品包含至少10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000个细胞。55.如权利要求46所述的方法，其中所述一种或多种样品获自相同受试者。56.如权利要求46所述的方法，其进一步包括使所述样品与溶解缓冲液接触。57.如权利要求46所述的方法，其进一步包括：使所述样品与核酸标记物接触，由此允许所述核酸标记物结合于所述样品的子集；和洗涤所述样品，由此从所述核酸标记物不结合的样品去除所述核酸标记物，其中关于所述子集内的样品，添加至与所述样品缔合的所述RNA中的所述衔接分子也添加至所述核酸标记物中，并且使用所述核酸标记物制造一种或多种所关注的聚核苷酸。58.如权利要求57所述的方法，其中所述核酸标记物包含偶联于分子标记的核酸。59.如权利要求58所述的方法，其中所述分子标记为抗体、抗原或蛋白。60.如权利要求58所述的方法，其中所述分子标记对一种或多种细胞表面部分具有亲和力。61.如权利要求58所述的方法，其中所述核酸为RNA。62.如权利要求58所述的方法，其中所述核酸为DNA。63.如权利要求62所述的方法，其中所述DNA包含RNAP启动子。64.如权利要求58至63中任一项所述的方法，其中：所述样品与第一核酸标记物和第二核酸标记物接触，所述第一核酸标记物包含偶联于第一分子标记的第一核酸，所述第二核酸标记物包含偶联于第二分子标记的第二核酸，所述第一核酸和第二核酸包含不同的序列区，并且所述第一和第二分子标记为不同的。65.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种样品获自相同受试者。66.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种样品获自至少3、10、30或100个不同受试者。67.一种衔接构建体，其包含RNAP启动子序列、通用引发序列、条形码序列和结合位点。68.如权利要求67所述的衔接构建体，其中所述RNAP启动子选自由T7、T3和SP6组成的组。69.一种衔接构建体，其包含切口核酸内切酶限制位点、通用...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·C·谭，G·威西，
申请(专利权)人：阿特雷卡公司，
类型：发明
国别省市：美国;US