快速恒温检测金黄色葡萄球菌的方法、引物及应用技术

本发明专利技术公开了一种快速恒温检测金黄色葡萄球菌的方法、引物组及试剂盒。所述方法为：从待测样品中提取基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，以能扩增金黄色葡萄球菌特异性序列的引物组为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌。本发明专利技术检测方法具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低，具广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速恒温检测金黄色葡萄球菌的方法、引物及试剂盒。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)隶属于葡萄球菌属，菌体球形，是一种革兰氏阳性细菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。同时其产生的肠毒素可污染食物而致食物中毒，为人类带来非常严重的公共卫生负担。因此，对于该菌的预防和检测非常重要。目前，国际上对金黄色葡萄球菌的检测普遍采用传统培养方法，但检测周期较长，操作相对复杂，检测效率较低，难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。近年来随着核酸分子检测技术的发展，研究人员陆续开发出了PCR和荧光PCR技术的检测手段，但是这两种方法需要专门的检测仪器，因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的金黄色葡萄球菌。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,NucleicAcidsResearch,2000Jun15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。引物设计是LAMP技术中最为关键的一步，常规做法是将某待检测生物的公认的特异性基因导入LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e)，设定相关参数生成引物组。也就是说，用户首先必须确保该靶基因为待测物种的特异序列。以专利技术专利CN101701252B和CN101880711A为例，它们分别针对文献报道的金黄色葡萄球菌的特异基因——nuc基因和clfA基因，采用LAMP技术进行金黄色葡萄球菌检测。然而，所谓“公认的特异性基因”往往基于滞后的知识，并未基于不断增长的微生物基因组数据进行必要的更新，导致基于该靶基因序列获得的引物在实际应用中不一定能确保其通用性和/或特异性。本专利技术用表1展示了现有技术中存在的通用性不能确保的问题。也就是说，现有技术方法中所使用的金黄色葡萄球菌检测序列实际上并非金黄色葡萄球菌所共有，即，有可能漏检金黄色葡萄球菌的部分菌株。类似的问题也存在于特异性的确认，即，有可能将非金黄色葡萄球菌错误地认定为金黄色葡萄球菌。因此，行业内亟需一种能够确保特异性和通用性的金黄色葡萄球菌检测方法，同时满足基层检测部门对快速、便捷的需求，能够方便地在企业生产线内部开展实时实地检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别金黄色葡萄球菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本专利技术基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源(截至2013年8月5日数据)进行金黄色葡萄球菌LAMP引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测金黄色葡萄球菌的方法、引物组及试剂盒。采用本专利技术的检测方法检测金黄色葡萄球菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。本专利技术提出一种快速检测金黄色葡萄球菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从待测样品中提取基因组DNA；(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物，在酶反应体系下，进行恒温扩增反应；(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌。本专利技术恒温检测金黄色葡萄球菌菌株的方法，从待测样品中提取基因组DNA，以其为模板，以金黄色葡萄球菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应，然后，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌。其中，所述酶反应体系包括但不限于DNA聚合酶反应体系。本专利技术中，所述金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列为GI号为148266447的金黄色葡萄球菌的720465～720702bp位序列。本专利技术中，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组为所述基因组(GI号为148266447)的720465～720702bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。其中，所述金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列是指仅为金黄色葡萄球菌基因组所特有的，而其它微生物基因组所不包含的碱基序列。其中，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异碱基序列的引物组包括但不限于引物组A，或选自与该引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为83％及以上的引物组之任意一组。引物组A：上游外引物F3_A：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQIDNO：1)；下游外引物B3_A：5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’(SEQIDNO：2)；上游内引物FIP_A：5’-CATACCACTTTTGCATCAAGCTTGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQIDNO：3)；下游内引物BIP_A：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQIDNO：4)。本专利技术中，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异碱基序列的引物组还可以包括与前述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为83％及以上的引物组，该引物组包括但不限于以下引物组B：引物组B：上游外引物F3_B：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQIDNO：5)；下游外引物B3_B：5’-GATTGGACAACTGTTCTCC-3’(SEQIDNO：6)(与引物B3_A5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’同源性83％)；上游内引物FIP_B：5’-GGCATACCACTTTTGCATCAATGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQIDNO：7)；下游内引物BIP_B：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQIDNO：8)。本专利技术方法中，在一具体实施方案中，所述恒温扩增的酶反应体系为：1×BstDNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/LMg2+(MgSO4或MgCl2)，1.0-1.6mmol/LdNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速恒温检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从待测样品中提取基因组DNA；(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌；其中，所述金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列为GI号为148266447的金黄色葡萄球菌基因组的720465～720702bp位序列。

【技术特征摘要】
2015.09.02 CN 20151055691741.一种快速恒温检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从待测样品中提取基因组DNA；(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌；其中，所述金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列为GI号为148266447的金黄色葡萄球菌基因组的720465～720702bp位序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组序列为GI号为148266447的金黄色葡萄球菌基因组720465～720702bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物组A；或选自与所述引物组A序列或其互补链序列中单条序列同源性为83％及以上的引物组之任意一组；引物组A：上游外引物F3_A：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQIDNO：1)；下游外引物B3_A：5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’(SEQIDNO：2)；上游内引物FIP_A：5’-CATACCACTTTTGCATCAAGCTTGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQIDNO：3)；下游内引物BIP_A：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQIDNO：4)。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，与所述引物组A序列或其互补链序列中单条序列同源性为83％及以上的引物组包括以下引物组B：引物组B：上游外引物F3_B：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQIDNO：5)；下游外引物B3_B：5’-GATTGGACAACTGTTCTCC-3’(SEQIDNO：6)；上游内引物FIP_B：5’-GGCATACCACTTTTGCATCAATGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQIDNO：7)；下游内引物BIP_B：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQIDNO：8)。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶反应体系包括：1×BstDNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/LMg2+，1.0-1.6mmol/LdNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μLBstDNA聚合酶，0-1.5mol/L的甜菜碱。6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永梅，李亦学，韦朝春，李园园，李雪玲，刘伟，贾犇，陆长德，陆晓婷，
申请(专利权)人：上海旺旺食品集团有限公司，上海产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31