一种特异定量检测葡萄球菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种特异定量检测葡萄球菌的方法。本发明专利技术公开的一种重组溶葡球菌酶，为如下1）或2）所示：1）SEQ?ID?No.2中自N端起第13位至第258位氨基酸所示的蛋白；2）将1）的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明专利技术公开的一种特异定量检测葡萄球菌的方法是结合重组溶葡球菌酶的ATP生物发光法。本发明专利技术的方法操作快捷简单，对现场或临床定性定量检测葡萄球菌提供了理论支持，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。本专利技术公开的一种重组溶葡球菌酶，为如下1）或2）所示：1）SEQ?ID?No.2中自N端起第13位至第258位氨基酸所示的蛋白；2）将1）的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本专利技术公开的是结合重组溶葡球菌酶的ATP生物发光法。本专利技术的方法操作快捷简单，对现场或临床定性定量检测葡萄球菌提供了理论支持，具有良好的应用前景。【专利说明】
本专利技术涉及。
技术介绍
葡萄球菌是人类皮肤表面常见菌群，但它同时也是一种非常重要的致病菌，能够引起小到皮肤病大到肺炎及菌血症的威胁人类生命的疾病。不仅仅是人类，家畜也容易感染葡萄球菌，葡萄球菌的感染能够导致奶牛乳腺炎及鸡传染性关节炎，这严重威胁了食品健康，导致食品污染，带来重大经济损失。值得注意的是，耐药金黄色葡萄球菌的感染不断增加，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)，已成为一个主要关注，因为金黄色葡萄球菌是医院感染最常见的原因。因此，建立快速检测葡萄球菌的方法，对于防治葡萄球菌感染，进行早期治疗减少损失是非常必要的。溶葡球菌酶(Iysostaphin)是从模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)中分离出来的一种含锌的金属蛋白酶，具有内切酶活性，能够特异性水解革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖而产生破壁溶菌作用，溶葡球菌酶对金黄色葡萄球菌显示了强大的溶菌作用。ATP是所有生物，包括细菌的细胞中均有的能量分子。测定出样品中细菌细胞的ATP含量，即可得知细菌数。在Mg2+存在下，萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase),以D-荧光素、ATP、O2为底物，将化学能转化为光能，发出荧光。根据ATP与荧光素反应产生荧光的原理，可对微生物细胞内的ATP进行测定，从而定量检测细菌数(I)。1.Elroy, ff., Crystalline firefly luciferase:LH2+ATP ^ LH2AMP+PPLH2AMP+02 — L-AMP+light+H20.Methods in enzymology, 1963.6:p.445-448.
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供的一种重组溶葡球菌酶，为如下I) -2)中任一所示:I) SEQ ID N0.2中自N端起第13位至第258位氨基酸所示的蛋白；2) SEQ ID N0.2 所示的蛋白；3)将I)或2)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。上述基因中，所述编码基因为如下中至少一种:I) SEQ ID N0.1中自5’末端起第37位至第777位核苷酸所示的DNA分子；2) SEQ ID N0.1中自5’末端起第I位至第777位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白质的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码上述蛋白质的DNA分子。含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。一种定量检测能被重组溶葡球菌酶裂解的细菌的方法也属于本专利技术的保护范围，该方法是结合上述蛋白的ATP生物发光法，包括如下步骤:(I)绘制标准曲线I)用PBS制备不同浓度的葡萄球菌标准液，将50ul标准液中的细菌总数，记作A，得到不同浓度的葡萄球菌标准液对应的IgA ；2)取50 μ 11)中制备的不同浓度的葡萄球菌标准液分别加入比色杯中；3)在比色杯中加入100μ I含4.5ug上述蛋白的PBS，静置2min，使葡萄球菌充分裂解；4)吸取50ul荧光酶溶液加入到比色杯中，混匀；5)测定比色杯中溶液的荧光值，记作B，得到50ul各浓度的葡萄球菌标准液对应的 IgB ；6)以IgA为X轴，以IgB为Y轴，绘制标准曲线，得到线性回归方程；(2)测定待测葡萄球菌的活菌个数进行所述步骤(1)的操作，与所述步骤(1)唯一不同的是，将50μ I葡萄球菌标准液替换成50 μ I待测葡萄球菌液，得到50ul待测葡萄球菌液对应的IgM ；(3)将IgM带入线性回归方 程，计算IgM对应的细菌总数的Ig值，记作lgX，X即为50ul待测葡萄球菌液的活菌个数；所述能被重组溶葡球菌酶裂解的细菌为葡萄球菌；所述PBS 为 0.01mol/L ρΗ7.2 的 PBS ；所述比色杯为过滤比色杯；所述步骤(1)和步骤(2)的葡萄球菌为同一种葡萄球菌；所述方法为非疾病诊断或治疗方法，具体可应用于科研用途。上述方法中，所述步骤(1)的2)还包括如下步骤:向比色杯中滴加非细菌细胞释放液，用压力器将比色杯中的液体压出，重复该步骤一次；上述任一所述的方法中，所述非细菌细胞释放液和荧光酶购自北京浩正智信科技有限公司。上述任一所述的方法中，所述葡萄球菌标准液中的细菌总数分别为2239666、223966、22396、2259、186 和 26cfu。所述荧光值的测定原理为:在Mg2+存在下，萤火虫荧光素酶以D-荧光素、ATP、O2为底物，将化学能转化为光能，发出荧光；上述任一所述的方法中，所述荧光值的测定是在Profile-13560 (IOX)ATP微生物快速检测系统上进行的。上述任一所述的方法中，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌。上述蛋白在定量检测能被重组溶葡球菌酶裂解的细菌中的应用也属于本专利技术的保护范围；和/或，上述蛋白在制备定量检测能被重组溶葡球菌酶裂解的细菌的产品中的应用也属于本专利技术的保护范围；和/ 或，上述任一所述的方法在定量检测能被重组溶葡球菌酶裂解的细菌中的应用也属于本专利技术的保护范围；所述应用为非疾病诊断或治疗方法，具体可应用于科研用途。上述应用中，所述能被重组溶葡球菌酶裂解的细菌为葡萄球菌。上述任一所述的应用中，所述葡萄球菌为金黄色葡萄球菌。实施例所用的纯化得到的重组溶葡球菌酶带有His标签，此标签不影响重组溶葡球菌酶的活性。本专利技术建立的结合重组溶葡球菌酶的ATP生物发光法操作快捷简单，对现场或临床定性定量检测葡萄球菌提供了理论支持，具有良好的应用前景。【专利附图】【附图说明】图1为上清I和对照上清的SDS-PAGE检测。图2为上清I和镍柱纯化获得的重组溶葡球菌酶的SDS-PAGE检测。图3为点滴法检测重组溶葡球菌酶体外杀菌活性。图4为结合重组溶葡球菌酶的ATP发光法与平板计数法相关性分析。图5为结合重组溶葡球菌酶的ATP发光法检测葡萄球菌的特异性。【具体实施方式】下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。`pQE30质粒在文献“范公忍，et al.，乙型肝炎病毒聚合酶片段的表达及其在血清学检测中的应用.解放军医学杂志，2010.2:p.015.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。克隆菌株E.coli Transl-Tl购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为D501-02。表达菌株E.coli M15购自北京博迈德生物技术有限公司，产品目录号为CC0901。金黄色葡萄球菌(Staphylococcu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组溶葡球菌酶，为如下1）或2）所示：1）SEQ?ID?No.2中自N端起第13位至第258位氨基酸所示的蛋白；2）将1）的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：童贻刚，李玉元，米志强，安小平，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：