本发明专利技术公开了一株海洋细菌中具有立体选择性脱卤酶的分离纯化方法及其在生物拆分中的应用。该方法从一株海洋细菌施氏假单胞菌(Pseudomonas?stutzeri)中分离纯化得到2种具有立体选择性的2-卤代酸脱卤酶，为L-2-卤代酸脱卤酶和D-2-卤代酸脱卤酶。L-2-卤代酸脱卤酶该酶亚基酶表观分子量在约26kDa，在pH8-11的范围内具有很好的反应活性。该酶选择性催化转化手性的L-2-卤代酸，生成构型转变的D-羟基卤代酸。D-2-卤代酸脱卤酶能够催化转化D-2-卤代酸，生成L-2-羟基酸，作为一种手性手性拆分试剂具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一株海洋细菌中具有立体选择性脱卤酶的分离纯化方法及其在生物拆分中的应用。该方法从一株海洋细菌施氏假单胞菌(Pseudomonas?stutzeri)中分离纯化得到2种具有立体选择性的2-卤代酸脱卤酶，为L-2-卤代酸脱卤酶和D-2-卤代酸脱卤酶。L-2-卤代酸脱卤酶该酶亚基酶表观分子量在约26kDa，在pH8-11的范围内具有很好的反应活性。该酶选择性催化转化手性的L-2-卤代酸，生成构型转变的D-羟基卤代酸。D-2-卤代酸脱卤酶能够催化转化D-2-卤代酸，生成L-2-羟基酸，作为一种手性手性拆分试剂具有良好的应用前景。【专利说明】一种南代酸脱南酶的提取纯化方法
本专利技术设计卤代酸脱卤酶,具体地说是施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的卤代酸脱卤酶的分离纯化方法及其应用。技术背景卤代有机化合物是精细化工，医药等重要的原料及中间体。脱卤酶是一类能够使卤素从卤代化合物中释放出来的一类酶。它不仅在降解环境有机卤化物中起到重要的作用，而且其立体选择性催化活性在手性拆分及制备手性化合物上也具有良好的应用前景。目前，已发现的产脱卤酶的细菌绝大部分来自于陆生环境，来自于海洋环境的微生物则极少。海洋中含有丰富的卤素离子，生活在高卤素浓度环境中的海洋生物所产生的卤素有机物也非常高，然而，菌种、气候、海域环境等因素，都会造成酶的性质及活性差异。因而筛选新的卤代酸脱卤酶会对该酶的工业应用奠定良好的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供卤代酸脱卤酶的分离提纯的方法及用于外消旋的2-卤代酸的手性转化。为实现上述目的，本专利技术技术方案如下:卤代酸脱卤酶的分离提取方法，其以施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)为原料，提取并分离纯化得到两种卤代酸脱卤酶，且两种酶的立体选择性相反。具体操作过程如下，1)收集的菌体，用10-100mM的磷酸盐缓冲液(pH6_9)清洗后，超声破碎细胞；2)于 0-10°C，3000~l5000rpm 离心 10-60min，取上清；3)上清液中加入硫酸铵制成20-40%的硫酸铵饱和度，搅拌l_2h后，离心取蛋白沉淀物，用PH4-10的磷酸盐缓冲液分别重溶后，得到降解D-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶，进一步用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为lOOOODa。4)在3)的基础上所得的上清进一步加入硫酸制成60-100%的硫酸铵饱和度，搅拌1-2h后，离心去沉淀的蛋白，用pH4-10的磷酸盐缓冲液重溶后，得到降解L-2-氯丙酸的卤代酸脱卤酶，最后用超滤膜超滤除盐，膜的截留分子量为10kDa.所述硫酸铵分级沉淀所得卤代酸脱卤酶还可以采用阴离子交换树脂及琼脂糖树脂进一步纯化，具体为:1)所得两种卤代酸脱卤酶分别经阴离子柱交换柱层析分离。用NaCl(0-1M)或Na2SO4 (0-0.3M)进行线性梯度洗脱，得到活性组分。酶液体积与洗脱液体积比为1:20-40。收集活性组分并测定蛋白含量。2)将离子交换柱所得活性组分经超滤浓缩后，上凝胶柱，用0.02-0.08M，pH4_9的磷酸钾缓冲液洗脱分离，得到卤代酸脱卤酶。所述阴离子交换树脂为DEAE-Sepharose FF, Q-Sepharose FF, Q-Sepharose XL或Q-sepharose HP。琼脂糖凝胶树脂为 Sephacryl S200, Superdex 200 或 Sephadex GlOO0外消旋的2-卤代酸的手性转化方法的具体技术方案如下:lmL反应体系中含加入手性的5-50mM 2-卤代酸，50_100mM缓冲液及脱卤酶。在30°C反应0.5_24h后，加入1%(ν/V)浓磷酸(85%，w/v)终止反应，得到转化产物。所述缓冲液为K2HPO4-K2HPO4 (pH7.5)时，酶的加入量为:0.1-0.8mL ;缓冲液为Glycine-NaOH(pH 10.0)时，酶的加入量为:0.05-0.lmL。有益效果本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果1.从施氏假单胞菌中分离纯化得到卤代酸脱卤酶。利用本技术，在施氏假单胞菌中首次分离纯化得到2种具手性选择性的卤代酸脱卤酶。2.本专利技术作为一种具有选择性降解卤代酸的脱卤酶具有良好的应用前景。本专利技术分离得到的卤代酸脱卤酶可将卤代酸选择性脱齒，得到相应的手性羟基酸。3.由于能够降解卤代酸，且对两种手性的卤代酸起作用，可应用于环境领域，消除卤代酸对环境的危害。【具体实施方式】卤代酸脱卤酶的分离纯化以海洋细菌施氏假单胞菌为原料，采用硫酸铵沉淀，超滤，离子交换柱和凝胶柱分离等多种分离手段相结合的方法，得到较纯的两种卤代酸脱卤酶。L-2-卤代酸脱卤酶能够选择性催化转化L-2-氯丙酸。表观分子量为25kDa。在pH8-11之间表现出较好的活性。D-2-卤代酸能够催化转化D-2-氯丙酸。分类地位:施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),属于细菌域(Bacteria),变形菌门(Proteobacteria),Y _变形菌纲(Gammaproteobacteria)，假单胞菌目(Pseudomonadales)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，假单胞菌属(Pseudomonas.)。下述实施例中所用施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 203096 ;中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，地址:武汉市武昌珞珈山(武汉大学)，邮编:430072，电话:(027)-68752319 ;其发表于现有的专利，专利申请号为200310111556.X，是:施氏假单胞菌ZWLR2-1及其制法和应用，菌能降解1_氯-硝基苯。1、菌体培养:I)种子液的培养:将施假单胞菌菌种在2216E固体平板培养基中划线，30°C复苏培养，然后在含2216E培养基(IOmL)的试管中培养I天，得种子液A。取3_5mL种子液A接种到含2-氯丙酸培养基(IOOmL/瓶)中培养，经培养48h后得到种子液B。种子液A及种子液B均在摇床(200rpm，30°C)下暗处培养。a)2216E培养基:在IL的水中，加入蛋白胨(5.0g/L),酵母浸粉(lg/L)，FeCl3 (0.lg/L), NaCl (30g/L)及琼脂粉(15g/L)，培养基pH为7.5，121°C灭菌后，倒平板制成固体培养基后备用。2216E液体培养基除了不含有琼脂粉外，其它成分同固体培养基。b)2_氯丙酸(2-CPA)液体培养基:培养基中含Na2HPO4.12H20 (12g/L)，NaH2PO4.2H20 (lg/L)，NaCl (30g/L)，酵母浸粉(0.1gL)，(NH4)2S04(2.0g/L)，MgSO4.7H20(0.lg/L)及 IOmL 微量元素母液(见参考文献 Van der Ploeg J, Van HallGj Janssen DB.Characterization of the haloacid dehalogenase from Xanthobacterautotrophicus GJlO and sequencing of the dhlB gene.Journal Of B本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种卤代酸脱卤酶的提取纯化方法，其特征在于：以施氏假单胞菌（Pseudomonas?stutzeri）为原料，分离纯化手性选择性相反的2种卤代酸脱卤酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张锦友，薛松，曹旭鹏，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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