【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
,具体涉及一种快速恒温检测假结核耶尔森氏菌的方法、引物及试剂盒。
技术介绍
假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)属于肠杆菌科耶尔森氏菌属,是一种人畜共患的肠道病原菌,该菌可在低温环境下生存,因此冰箱储存食物是现代社会发生该菌感染的一个重要传染源,可引起胃肠道症状、肠系膜淋巴结炎等。该菌感染在人群中以散发为主,偶尔也会引起不同规模的暴发。由于其临床症状不典型,极易造成诊断不明甚至误诊而延误治疗。因此,对于该菌的预防和检测非常重要。传统假结核耶尔森氏菌检测方法由于检测周期较长,操作相对复杂,检测效率较低,难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。近年来随着核酸分子检测技术的发展,研究人员也开发出了PCR等检测手段,但是该方法需要专门的检测仪器,因此,并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为了确保食品安全,急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的假结核耶尔森氏菌。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法,该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP,其中FIP由F1C和F2组成,BIP由B1C和B2组成),利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件保温约60min,即可完成核酸扩增反应,产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献NotomiT,Okay ...
【技术保护点】
一种快速恒温检测假结核耶尔森氏菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)从待测样品中提取基因组DNA;(2)以所述基因组DNA为模板,以能扩增假结核耶尔森氏菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物,在酶反应体系下进行恒温扩增反应;(3)通过判断反应结果是否为阳性,确定待测样品中是否存在假结核耶尔森氏菌;其中,所述假结核耶尔森氏菌基因组特异性碱基序列为GI号为153946813的假结核耶尔森氏菌基因组的769086~769323bp位序列。
【技术特征摘要】
2015.09.02 CN 20151055691741.一种快速恒温检测假结核耶尔森氏菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)从待测样品中提取基因组DNA;(2)以所述基因组DNA为模板,以能扩增假结核耶尔森氏菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物,在酶反应体系下进行恒温扩增反应;(3)通过判断反应结果是否为阳性,确定待测样品中是否存在假结核耶尔森氏菌;其中,所述假结核耶尔森氏菌基因组特异性碱基序列为GI号为153946813的假结核耶尔森氏菌基因组的769086~769323bp位序列。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述能扩增假结核耶尔森氏菌基因组特异性碱基序列的引物组序列为GI号为153946813的假结核耶尔森氏菌基因组769086~769323bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述能扩增假结核耶尔森氏菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物组A;或选自与所述引物组A序列或其互补链序列中单条序列同源性为61%及以上的引物组;引物组A:上游外引物F3_A:5’-GTCGTTACTGGCTGTGGATG-3’(SEQIDNO:1);下游外引物B3_A:5’-TTGCCAGCGTAAAGTCGG-3’(SEQIDNO:2);上游内引物FIP_A:5’-TGATTTCTCATTAGACGCCTGCCGTACCGATGGACAACAAACCC-3’(SEQIDNO:3);下游内引物BIP_A:5’-GGGGCCACGACCATTATCAAGCAACGCCACTTTCCAAGCG-3’(SEQIDNO:4)。4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,与所述引物组A序列或其互补链序列中单条序列同源性为61%及以上的引物组包括以下引物组B:引物组B:上游外引物F3_B:5’-GTCGTTACTGGCTGTGGATG-3’(SEQIDNO:5);下游外引物B3_B:5’-GCCATCATTGCCAGCGTA-3’(SEQIDNO:6);上游内引物FIP_B:5’-TGATTTCTCATTAGACGCCTGCCGTACCGATGGACAACAAACCC-3’(SEQIDNO:7);下游内引物BIP_B:5’-GGGGCCACGACCATTATCAAGCAACGCCACTTTCCAAGCG-3’(SEQIDNO:8)。5.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述能扩增假结核耶尔森氏菌基因组特异性碱基序列的引物组还包含一条环引物;所述环引物为LF。6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述能扩增假结核耶尔森氏菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下引物组A’,B’之任意一组;或选自与所述引物组A’,B’序列或其互补链序列中单条序列同源性为61%及以上的引物组之任意一组:引物组A’:上游外引物F3_A:5’-GTCGTTACTGGCTGTGGATG-3’;下游外引物B3_A:5’-TTGCCAGCGTAAAGTCGG-3’;上游内引物FIP_A:5’-TGATTTCTCATTAGACGCCTGCCGTACCGATGGACAACAAACCC-3’;下游内引物BIP_A:5’-GGGGCCACGACCATTATCAAGCAACGCCACTTTCCAAGCG-3’;上游环引物LF_A:5’-TCCAAGAGTCCAACGTGGCAAA-3’(SEQIDNO:9);引物组B’:上游外引物F3_B:5’-GTCGTTACTGGCTGTGGATG-3’;下游外引物B3_B:5’-GCCATCATTGCCAGCGTA-3’;上游内引物FIP_B:5’-TGATTTCTCATTAGACGCCTGCCGTACCGATGGACAACAAACCC-3’;下游内引物BIP_B:5’-GGGGCCACGACCATTATCAAGCAACGCCACTTTCCAAGCG-3’;上游环引物LF_B:5’-TCCAAGAGTCCAACGTGGCAAA-3’(SEQIDNO:10)。7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述酶反应体系包括:1×BstDNA聚合酶反应缓冲液,2-9mmol/LMg2+,1.0-1.6mmol/LdNTP,0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物,0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物,0.16-0.64U/μLBstDNA聚合酶,0-1.5mol/L的甜菜碱,包括或不包括0.4-1.0μmol/L的L...
【专利技术属性】
技术研发人员:曹永梅,李园园,李雪玲,韦朝春,贾犇,刘伟,陆长德,李亦学,
申请(专利权)人:上海旺旺食品集团有限公司,上海产业技术研究院,
类型:发明
国别省市:上海;31
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