一种实时监控肝癌复发或转移的CD133、EpCAM和CK19联合检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及医学生物检测技术领域，具体是一种用于检测循环肿瘤细胞中CD133、EpCAM及CK19的表达情况，以实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的试剂盒及其相应的检测方法。本发明专利技术为实时监控肝癌的复发、转移提供了简便快捷、经济、准确的检测手段，以便及时调整治疗方案，尽早进行临床干预，防止病情进展，改善患者预后。本发明专利技术为肝癌肝移植术后诊断肝癌复发及转移、改善肝癌的预后提供了新的手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学生物检测
，具体地说，是一种用于检测循环肿瘤细胞中CD133、EpCAM及CK19的表达情况，来实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的试剂盒及其相应的检测方法。
技术介绍
肝癌具有起病隐匿，进展快，病死率高的特点，是全世界最常见的恶性肿瘤之一。在《全球癌症报告2014》中显示，中国新增癌症病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位。目前，我国肝癌的发病率约为25.7/10万，成为死亡率仅次于胃癌、肺癌的第三大恶性肿瘤，可见肝癌在我国所处形势之严峻。限于现有的检测技术水平，大多数肝癌患者在确诊时已处于中晚期，对疾病治疗极不乐观；另外，肝癌在术后有较高的复发率，且易出现耐药，因此，尽管患者积极治疗，但整体治疗效果及预后仍然比较差，术后五年生存率仍低于20％。近年来如何改善肝癌患者预后，提高患者生存率一直是临床医生和广大科研工作者研究的热点和难点。目前，最常用的肝癌筛查和监测手段是检测血浆中甲胎蛋白(Alphafetoprotein，AFP)水平和影像学检查如肝脏超声、核磁共振等。然而，尽管AFP是全世界应用最广泛的肝癌肿瘤标志物，但其敏感性(约40％～65％)和特异性(约76％～96％)均不令人满意：如妊娠妇女和新生儿、生殖细胞肿瘤、一些非恶性疾病如肝炎、肝硬化、先天性胆管闭塞等也可能出现AFP偏高现象，而约有33％的小型肝癌却不会出现AFP升高的现象。随着治疗方法和影像检测技术水平的提高，发达国家对于肝癌(<3cm)的发现已经明显增强，但是影像学检查，如核磁共振对于1～2cm的肝癌也仅有30％。早发现早治疗这对患者预后改善和临床治疗效果提高至关重要，已有的临床研究结果显示，肝癌早期治疗后五年生存率可达50％左右。肝癌早期诊治或肝癌手术治疗后若能够准确早期预测患者的结局，那将为术后的个体化治疗提供决策依据，这对患者生存期有着直接影响。因此，在肝癌治疗中迫切需要一种能够早期检测肝癌复发或转移的新的检测技术。循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,CTC)是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞，其在肿瘤发展的超早期就有可能在外周血中检测到。通过CTC检测能够为肿瘤的临床进展、疗效判断和预后评估等提供极具价值的科学依据，其已是目前肿瘤液态活检研究的热点之一。在外周血中检测到CTC，预示着患者肿瘤有复发或转移的倾向。另外，CTCs能够反映肿瘤特征，通过CTC的检测可以解决样本来源困难，尤其是术后无肿瘤组织样本的患者肿瘤进展检测的难题。因此，通过结合CTC检测可实现对肝癌肝移植术后患者肿瘤复发或转移的早期检测。CK19作为一种已知的干细胞标记物，常常被用于原发性肝癌的研究。CK19不仅可以破坏基质，引起细胞形态的改变，还可破坏细胞外基质，利于肿瘤细胞转移、迁徙，发生更具侵袭性的生物学行为，从而降低总体生存率。多项临床研究已经证实，CK19的阳性表达可以增强细胞的增殖能力与侵袭性，使肿瘤恶性程度增加，最终导致患者预后不良。另有学者发现，甚至在调整了其他危险因素的干扰后，CK19阳性仍是严重影响HCC患者术后不良预后的独立指标。CK19阳性表达高，导致患者易复发且预后差。CD133被认为是迄今为止发现的肝癌干细胞最重要的标志物。多项实验证实，CD133+细胞与肿瘤的信号转导、免疫逃逸、放疗抵抗和药物耐受等都有重要相关性。研究表明，CD133强表达的肝癌患者生存期明显较CD133弱表达组的短。Sasaki等在肝癌的研究也发现，CD133的表达与HCC患者的总生存期相关，细胞质表达CD133是影响HCC患者总生存的非常显著的危险因素。检测肝癌患者外周血CD133表达，分析其与临床病理特征、肿瘤远端转移等的相互关系，具有重要的临床意义。EpCAM是一种在人类许多上皮组织、肿瘤组织和干细胞中均有表达的跨膜糖蛋白，包括几乎所有的腺癌、某些鳞癌、视网膜细胞瘤和肝癌。EpCAM不仅是肿瘤细胞增殖的标志，也是肝癌干细胞的表面标志。有研究发现，肝癌患者体内存在循环干细胞样EpCAM+细胞，可作为肝癌根治性切除术后预后不良的一个重要指标。Du等的研究发现，EpCAM在转移性胃癌中较非转移性胃癌明显高表达。Osta等研究发现，EpCAM在乳腺癌组织中的表达量是正常组织的100～1000倍。可见，EpCAM可促进肿瘤细胞的侵袭转移，其在预测肿瘤转移倾向、判断肿瘤预后中有重要指示作用。CD133、EpCAM、CK19或均可作为独立的预后因子，但其独立预后仍有较大的局限性，存在一定的假阴性率。而本专利技术检测试剂盒及检测方法将这三种肿瘤标志物联合起来，共同作为肝癌肝移植术后检测的指标，可更好地评估肝癌的生物学行为，使检测结果更准确，预后更精准。目前尚未见应用CTC的CD133、EpCAM和CK19三瘤标的表达联合监测肝癌肝移植术后复发或转移的相关文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组能够实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的的特异性分子标记物。本专利技术的另一目的在于提供一种用于检测循环肿瘤细胞中CD133、EpCAM及CK19的表达情况，来实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的检测试剂或试剂盒，及其相应的检测方法。为了实现上述目的，本专利技术的主要技术方案是：本专利技术通过富集肝癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTC)并检测循环肿瘤细胞中CD133、EpCAM及CK19三种肿瘤标志物的表达情况，以实现对肝癌患者肝移植术后肿瘤的复发、转移进行实时监控。首先，采用差相富集的方法收集循环肿瘤细胞。即通过密度梯度离心去除红细胞，再通过免疫磁珠与密度梯度离心相结合的方法去除白细胞，最后收获循环肿瘤细胞CTC。其次，对富集到的循环肿瘤细胞进行RNA抽提，对获得的mRNA进行逆转录获得cDNA，再通过实时荧光定量PCR监测其CD133、EpCAM及CK19三种肿瘤标志物的表达情况。最后，以GAPDH为内参，三种瘤标的表达结果通过计算。分设CTC联合三种瘤标单独进行检测肝癌复发或转移，以及CTC同时联合三种瘤标检测肝癌复发或转移，即：CTC-qPCR(CD133)检测、CTC-qPCR(EpCAM)检测、CTC-qPCR(CK19)检测、CTC-qPCR(CD133+EpCAM+CK19)检测。同时采用ROC曲线及卡方检验两种检验方法共同评判检测结果。除以上分组的结果分析，另外定义三瘤标同时检测的另一种判定标准来进行结果分析，即有二项或者三项阳性的为CTC-qPCR检测结果阳性，只有一项阳性或全为阴性的为CTC-qPCR检测结果阴性。ROC曲线及卡方检验两种检验方法分析的结果具体如下表1所示。两种分析结果均显示二项或者三项阳性为阳性判读标准的三瘤标联合检测的敏感性和特异性最佳，且ROC曲线检验显示其相对于其他瘤标单独检测具有显著差异。表1ROC曲线及卡方检验两种检验方法分析结果综上可见，CTC同时联合三种瘤标联检的敏感性及特异性均优于CTC联合单独肿瘤标志物的检测。三个肿瘤标志物一致升高作为联合检测指标，能够增加该试剂盒检测的特异性。单独肿瘤标志物分析检测敏感性较低，容易导致阳性患者漏诊，三个分子联合检测敏感性较高，减少了漏诊患者。本专利技术的第一方面，提供一组能够有效用于肝癌肝移植术后复发、转移诊断本文档来自技高网...

【技术保护点】
CD133、EpCAM和CK19在制备实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的检测试剂或试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.CD133、EpCAM和CK19在制备实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的检测试剂或试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的CD133、EpCAM和CK19在制备实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂或试剂盒通过检测循环肿瘤细胞中CD133、EpCAM和CK19的含量监控肝癌肝移植术后复发或转移。3.根据权利要求1所述的CD133、EpCAM和CK19在制备实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂为检测循环肿瘤细胞中CD133含量、EpCAM含量和CK19含量的试剂的组合。4.根据权利要求1所述的CD133、EpCAM和CK19在制备实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒包含检测循环肿瘤细胞中CD133含量的试剂、EpCAM含量的试剂，和CK19含量的试剂。5.根据权利要求2-4任一所述的CD133、EpCAM和CK19在制备实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的循环肿瘤细胞来自：获自对象的新鲜肿瘤组织或外周血全血。6.根据权利要求3或4所述的CD133、EpCAM和CK19在制备实时监控肝癌肝移植术后复发或转移的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测循环肿瘤细胞中CD13...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛峰，夏强，顾健人，张桢珍，施少军，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：上海;31