血清外泌体miRNAs标志物在地方性砷中毒早期诊断中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程与临床医学领域，具体涉及与地方性砷中毒早期诊断相关的血清外泌体miRNAs标志物及其应用，该标志物为has‑miR‑155、has‑miR‑191的组合。该标志物及其引物可用于制备地方性砷中毒早期诊断试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于因工程与临床医学
，具体涉及人类地方性砷中毒早期发生相关的血清外泌体微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)标志物及其应用。
技术介绍
地方性砷中毒简称地砷病，是一种生物地球化学性疾病，是居住在特定地理环境条件下的居民，长期通过饮水、空气或食物摄入过量的无机砷而引起的以皮肤色素脱失或/和过度沉着、掌跖角化及癌变为主的全身性的慢性中毒。地砷病是一种严重危害人体健康的地方病。除致皮肤改变外，无机砷是国际癌症研究中心确认的人类致癌物，可致皮肤癌、肺癌，并伴有其他内脏癌高发。在重病区，当切断砷源后或离开病区，经过多年仍有地砷病的发生，表明由砷引起的毒害可持续存在很长时间，并逐渐显示出远期危害—皮肤改变，恶性肿瘤及其他疾病等。临床上，地砷病多为慢性砷中毒表现。在不同病区，由于携砷介质不同及摄入量的差异，临床表现不尽相同。在轻病区病人往往只有轻的皮肤病变而无明显的临床症状。在重病区病人体征明显，常伴有不同程度的临床症状，同时心血管病、肝病、肿瘤等并发也较多见。地方性砷中毒在全球许多国家流行，目前正威胁着至少22个国家和地区的5000多万人口，已成为世界性严重危害人类健康的公共卫生问题之一，包括由长期饮用高砷水引起的饮水型地方性砷中毒和燃用高砷煤导致室内空气或食物污染引起的燃煤污染型地方性砷中毒，其中后者是我国特有的地方性砷中毒类型，仅流行于贵州(1976年确认)和陕西(2005年确认)两省。我国政府高度重视地方性砷中毒防控问题，“十五”以来持续将其列为国家重点防治疾病和“健康中国2020行动计划”，目前在环境干预、人群行为干预等方面取得瞩目成就。但由于燃煤型砷中毒影响因素复杂，低砷污染状况仍有存在，健康危害具有累积性和难可逆性，停止接触后病情仍可持续发展，特别是机制不明和无特效治疗药物或方案致病人病情未得到明显控制。因此，本专利技术主要目标就是在燃煤型砷中毒的早期诊断中探索重要生物学标志物，为早期诊断提供可靠依据，使砷中毒在早期得以有效的控制。表观遗传学是指DNA序列不发生改变，但基因表达却发生了可遗传改变的现象，包括DNA甲基化(DNAmethylation)、组蛋白修饰(histonemodification)、非编码RNA(noncodingRNA，ncRNA)及染色质重塑等，其具有可遗传和可逆转等特征；还有报道认为表观遗传学改变可能早于遗传信息改变，且较遗传学改变更为普遍。近年来环境化学物引起表观遗传模式改变与疾病发生关系备受关注，深入研究表观遗传调控机制在地方性砷中毒所致机体损伤和肿瘤中的作用及其过程将成为本专利技术研究的重点。微小核糖核酸(microRNAs，即miRNAs)是近年刚刚兴起的研究热点，它是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，多位于基因组非编码区，进化上高度保守，其通过与靶基因mRNAs的3’UTR区结合后，对靶基因mRNA剪切或抑制翻译而下调蛋白表达水平。miRNAs能调控多种生物学过程，包括细胞周期、凋亡、分化、发育和新陈代谢等生理和病理过程，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。自参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNAs已逐渐成为调控mRNA稳定性和蛋白翻译的研究热点，分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。现在预测miRNAs至少能调控数千个人类基因，占所有基因的30％以上。随着研究的深入，越来越多的miRNAs被发现。目前，miRNAs与肿瘤的关系已成为研究的重点，已发现若干miRNAs通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。然而，但目前血清miRNAs与地方性砷中毒等的相互关系报道甚少。外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，1983年首次于绵羊网织红细胞中被发现，并1987年被Johnstone命名为“exosome”。其内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。越来越多的证据表明，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。发表于《自然》(Nature)杂志上的一篇论文中也证实了肿瘤释放了数百万携带着它们的蛋白质和遗传内容物的囊泡。这些囊泡像“通信船”或“侦察舰”一样，它们确保了受纳器官做好准备招待肿瘤细胞。具体说来，外泌体触发了受纳器官中必要的分子反应——炎症、血管形成等来欢迎肿瘤细胞，使得当肿瘤细胞到达时可以进行增殖。然而，血清外泌体miRNAs与地方性砷中毒等的相互关系尚未见报道。许多证据表明miRNAs可以稳定存在于体液中，包括唾液、尿液、母乳和血液。细胞外的miRNAs可以被装入外泌体或微囊泡中，还能被装载在高密度脂蛋白HDL上，这些都能保护它们不被降解，使它们稳定存在。随着囊泡的运输功能被日益挖掘，外泌体中的miRNAs的作用也受到越来越多的关注。它们通过循环囊泡传递信息，这被认为是细胞间信号交流的第三种途径，与细胞接触依赖的信号传导和通过可溶性分子介导的传导这两条途径一样重要。最新的研究成果发现血清中存在外泌体且携带miRNAs，使得miRNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，存在显著的疾病特异性，在肺癌、结肠癌中已经证实血清外泌体miRNAs的表达谱可作为早期诊断的潜在生物标志物。这一发现令人振奋，血清外泌体miRNAs作为一类非编码调节性的小分子RNA有可能取代传统的特异蛋白为代表的生物标志物，开拓了生物标志物的新境界。然而血清中外泌体miRNAs在地方性砷中毒早期诊断监测中的应用还未得到相应的关注，若能发现稳定的与地方性砷中毒早期发病相关的特异血清外泌体miRNAs作为生物标志物，并研发相应疾病的诊断、监测试剂盒，不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国地方性砷中毒的防治也将是一次强有力的推动。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提出一种与地方性砷中毒早期诊断相关的血清外泌体miRNA标志物及其应用。本专利技术的第二个目的是提供上述miRNAs标志物的特异性引物。本专利技术还有一个目的是提供上述血清外泌体microRNA标志物及其特异性引物在制备地方性砷中毒早期诊断试剂盒中的应用。本专利技术再有一个目的是提供人类地方性砷中毒早期诊断或监测的试剂盒。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：一种与地方性砷中毒早期诊断相关的血清外泌体miRNA标志物，该标志物为has-miR-155、has-miR-191的组合。hsa-miR-155的序列为UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU(SEQIDNo.1)，hsa-miR-191的序列为CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG(SEQIDNo.2)。所述的miRNA标志物的特异性扩增引物，其特征在于，该引物为：has-miR-155的上游引物序列为SEQIDNo.3，下游引物序列为SEQIDNo.4；has-miR-191的上游引物序列为SEQIDNo.5，下游引物序列为SEQIDNo.6。所述的miRNA标志物在制备地方性砷中毒早期诊断试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与地方性砷中毒早期诊断相关的血清外泌体miRNAs标志物，其特征在于：该标志物为has‑miR‑155、has‑miR‑191的组合。

【技术特征摘要】
1.一种与地方性砷中毒早期诊断相关的血清外泌体miRNAs标志物，其特征在于：该标志物为has-miR-155、has-miR-191的组合。2.根据权利要求1所述的miRNAs标志物的特异性扩增引物，其特征在于，该引物为：has-miR-155的上游引物序列为SEQIDNo.3，下游引物序列为SEQIDNo.4；has-miR-191的上游引物序列为SEQIDNo.5，下游引物序列为SEQIDNo.6。3.权利要求1所述的miRNAs标志物在制备地方性砷...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘起展，罗菲，陈超，刘欣璐，薛均超，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32