一种胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法，所述胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法从微生态系统的角度，以脱皮过程中胡椒表皮微生物为对象；通过提取胡椒表皮细菌的宏基因组DNA并纯化，扩增可变区序列后，应用高通量测序技术完成表皮细菌可变区序列的读取，利用生物信息学平台对序列进行质控并完成物种注释和功能预测，再次基础上借助统计学方法全面客观揭示胡椒脱皮过程中鲜果表皮起关键作用的微生物物种及其核心代谢途径。本发明专利技术简化了实验操作，提高了测序效率，从而极大地促进了宏基因组学的发展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法。
技术介绍
胡椒最早记载于唐显庆年间苏敬等人编著的《唐本草》，它是胡椒科胡椒属多年生常绿藤本植物。胡椒适合在湿润、高温、无风并土壤肥沃的地区生长，因此在赤道南北纬附件海拔500m以内的地区种植最为广泛。作为世界最主要的热带香辛料作物，胡椒最早生产于印度，随着胡椒的推广种植，该作物深受世界人民喜爱，并在医学和食品领域都有广泛的用途。明代，李时珍曾在《本草纲目》中谈及：“胡椒，因其辛辣似椒，故得椒名，实非椒也。胡椒辛热纯阳，走气助火，昏目发疮。”而现代医学表明，胡椒具有治疗胃寒呕吐腹痛泄泻，食欲不振，癫痫痰多的妙效。通过对胡椒果实的化学成分测定表明，其主要化学成分包括：生物碱(主要是吡咯烷类酰胺生物碱)、挥发油、有机酸、木脂素、酚类化合物和微量元素等，而含量最多的活性成分是胡椒碱。由于胡椒一直享有香料之王的美誉，近年来国际市场对胡椒的需求保持持续增长。在国际贸易中，黑胡椒贸易总量占80％，白胡椒占20％。而在白胡椒加工过程中，脱皮工艺尤为重要，脱皮的过程决定了白胡椒的品质，直接影响了白胡椒的色香味是否洁白芳香而浓郁，进而也是后续胡椒深加工产品的质量保障。目前，对于胡椒脱皮的研究还处于探索阶段，而常用的胡椒脱皮方法主要有浸泡脱皮去皮，酸碱处理后机械脱皮，酶法脱皮和有待完善的生物脱皮。最传统的胡椒脱皮方法是浸泡脱皮法，也称沤皮法。时至今日，该方法依然深受胡椒种植户的青睐。较之其余几种方法，该方法最大的优势是简单易行，直接将胡椒鲜果置于流动水中浸泡，先将经浸泡后果皮变腐烂的胡椒果在水池中直接用脚充分踩踏，然后用水反复冲洗并除去果梗等杂物直至充分洗净，再晾晒即可。虽然简单易行，但是该方法本身存在加工周期长、占地面积大、耗水量大、劳动强度大、沤臭味重和加工成本高等缺陷，且胡椒脱皮不彻底，成品质量不稳定，白胡椒得率相对较低。随着机械加工的盛行，一些研究院和企业合作研发出了胡椒脱皮机，其原理是先将胡椒鲜果经过高温蒸烫或者稀盐酸浸泡后放置于滚揉机中脱皮。该方法虽然脱皮比较彻底，但是存在热量和原料消耗过高的问题，而且胡椒容易受损，且脱皮废液很难符合国家废水排放标准，严重污染了环境，最终使得该方法难以推广。而酶法脱皮主要是利用果胶酶降解皮层所含的果胶类胶联物质。在室温下添加果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等酶处理胡椒，在静置或者搅拌的状态下通过酶解作用使得鲜果表皮完全降解。该方法不造成环境污染，制得成品质量较高。但是各种酶类的使用使得本方法成本太高，因此也无法普及。胡椒鲜果表皮的原果胶起交联作用，而原果胶主要是以(1，4)键键合的多聚D-半乳糖醛酸为基本结构的多糖类物质。生物脱皮法是近些年来针对胡椒脱皮的新思路，这种方法利用高产果胶酶的微生物群落对胡椒表皮进行发酵，分解原果胶使果皮分离开来进而达到脱皮的效果。与传统脱皮工艺比较，其脱皮生产周期相对短，还具有能耗较低，脱皮投入少，成品质量高，污染物排放少等优势。然而，该方法在推广过程中仍存在一些瓶颈，复杂的胡椒表皮胶质成分需要相应的复杂酶系，而这样的酶系目前尚未研究清楚，且微生物培养工艺要求较高。我国在微生物脱胶方面的研究取得了丰硕的成果，但缺少在胡椒脱皮上的应用试验。胡椒是热带地区的热带农产品，是广大农民创收的重要农作物，也是热带地区经济发展的一大特色产业。目前我国主要的胡椒产品是白胡椒，因此胡椒的初加工脱皮方法和白胡椒的质量就成为影响海南省乃至全国胡椒产业至关重要的因素。但目前我国的胡椒脱皮初加工还停留在传统浸渍法的水平，此法得到的胡椒品质低，不仅色泽发灰，而且带有严重的异味。因此继续优化微生物脱皮法，专利技术出一整套快速准确的胡椒脱皮过程中关键微生物及其功能基因的甄别方法，是后续复配出能提高胡椒品质、降低生产成本、易于实现工业化生产的微生态制剂的研究基础，因此意义格外重大。综上所述，目前我国的胡椒脱皮初加工还停留在传统浸渍法的水平，得到的胡椒品质低，不仅色泽发灰，而且带有严重的异味。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法，旨在解决目前我国的胡椒脱皮初加工还停留在传统浸渍法的水平，得到的胡椒品质低，不仅色泽发灰，而且带有严重异味的问题。本专利技术是这样实现的，一种胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法，所述胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法从微生态系统的角度，以脱皮过程中胡椒表皮微生物为对象；通过提取胡椒表皮细菌的宏基因组DNA并纯化，扩增可变区序列后，应用高通量测序技术完成表皮细菌可变区序列的读取，利用生物信息学平台对序列进行质控并完成物种注释和功能预测，借助统计学方法全面客观揭示胡椒脱皮过程中鲜果表皮起关键作用的微生物物种及其核心代谢途径。进一步，所述胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法具体包括以下步骤：步骤一，从胡椒表皮富集微生物，应用液氮冻融的方法获取细菌宏基因组DNA并纯化；步骤二，PCR扩增，以细菌16SrDNAV3-V4可变区为目的片段，应用通用引物完成该可变区片段的扩增和纯化；步骤三，应用基于二代测序原理的高通量测序仪完成扩增片段的序列读取；步骤四，通过生物信息学平台对测定序列进行解读，完成微生物物种的注释和功能基因的预测，同时应用统计学方法甄别在胡椒脱皮过程中起关键作用的微生物物种及其核心功能基因表达。进一步，胡椒表皮微生物宏基因组DNA的提取：在提取前增加液氮冻融加陶瓷珠击打破碎方式释放细胞内容物，而后应用CTAB法提取，获取DNA后用琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测DNA质量。进一步，胡椒表皮细菌可变区扩增包括：1)样本特异性条形码引物的设计：运用引物设计软件，设计样本V3-V4可变区特异性条形码高通量测序引物；2)细菌16SrRNAV3-V4可变区扩增：以微生物宏基因组DNA为模板，用上述设计的样本特异性条形码高通量测序引物进行PCR扩增。进一步，PCR产物经电泳检测和定量后，应用二代高通量测序平台对样品进行桥式PCR高通量测序，每个样品确保获得20,000条高质量序列。进一步，基于生物信息学平台，应用开源生信分析软件首先对原始测序读长进行质控，去除低质量序列保留高质量序列；在服务器上运行微生物多样性分析程序，经过选取代表性序列和与参考菌库比对后获得物种多样性信息，基于Unifrac进化距离分析样品之间的β多样性并解释不同之间点样品的群落构成动态变化；应用随机森林机器学习模型计算出各个菌种的权重和变化规律，使用功能预测开源软件对规律性变化微生物进行功能基因和代谢通路的注释。进一步，扩增引物：序列为：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法的胡椒脱皮方法。本专利技术提供的胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法，对采集自不同环境的胡椒进行脱皮过程动态监测，可以在24小时(1个工作日)内完成完成脱皮过程中关键微生物及其功能基因组的甄别，为胡椒的生物脱皮法提供微生物优选菌种参考，并为胡椒初加工产业化发展提供技术指导；可以在不进行微生物菌种培养的基础上，简便、快速、准确地定性定量甄别胡椒脱皮过程中的核心微生物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法，其特征在于，所述胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法从微生态系统的角度，以脱皮过程中胡椒表皮微生物为对象；通过提取胡椒表皮细菌的宏基因组DNA并纯化，扩增可变区序列后，应用高通量测序技术完成表皮细菌可变区序列的读取，利用生物信息学平台对序列进行质控并完成物种注释和功能预测，借助统计学方法全面客观揭示胡椒脱皮过程中鲜果表皮起关键作用的微生物物种及其核心代谢途径。

【技术特征摘要】
1.一种胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法，其特征在于，所述胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法从微生态系统的角度，以脱皮过程中胡椒表皮微生物为对象；通过提取胡椒表皮细菌的宏基因组DNA并纯化，扩增可变区序列后，应用高通量测序技术完成表皮细菌可变区序列的读取，利用生物信息学平台对序列进行质控并完成物种注释和功能预测，借助统计学方法全面客观揭示胡椒脱皮过程中鲜果表皮起关键作用的微生物物种及其核心代谢途径。2.如权利要求1所述的胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法，其特征在于，所述胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法具体包括以下步骤：步骤一，从胡椒表皮富集微生物，应用液氮冻融的方法获取细菌宏基因组DNA并纯化；步骤二，PCR扩增，以细菌16SrDNAV3-V4可变区为目的片段，应用通用引物完成该可变区片段的扩增和纯化；步骤三，应用基于二代测序原理的高通量测序仪完成扩增片段的序列读取；步骤四，通过生物信息学平台对测定序列进行解读，完成微生物物种的注释和功能基因的预测，同时应用统计学方法甄别在胡椒脱皮过程中起关键作用的微生物物种及其核心功能基因表达。3.如权利要求2所述的胡椒脱皮过程中关键微生物功能基因组的检测方法，其特征在于，胡椒表皮微生物宏基因组DNA的提取：在提取前增加液氮冻融加陶瓷珠击打破碎方式释放细胞内容物，而后应用CTAB法提取，获取DNA后用琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测DNA质量。4.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张家超，霍冬雪，李从发，刘四新，李武，胡淇淞，徐传标，彭倩楠，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南;46