本发明专利技术公开了本发明专利技术公开了食源性病原微生物-小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速核酸试纸条检测试剂盒制备及其应用方法，还公开了针对小肠结肠炎耶尔森氏菌的特异性核酸PCR扩增用引物的设计方法，用核酸侧向流核酸试纸条检测PCR扩增产物的方法以及用途。本发明专利技术的方法使用特异性核酸序列扩增产物可用于检测其他来源病原微生物目的核酸序列的扩增产物，其特异性由扩增引物保证。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和免疫学领域，涉及食品及加工原料中小肠结肠炎耶尔森氏菌的核酸扩增产物侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。
技术介绍
为有效控制食品生产和进出口贸易中因致病性微生物引起的食源性疾病，保证食品领域的公共安全，需要开发灵敏、便捷、准确的食源性病原微生物检测方法。在食源性疾病危险因素中，在我国流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒位居第一，而在食源性病原微生物中其中最典型的致病菌是小肠结肠炎耶尔森氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7等病原菌。小肠结肠炎耶尔森氏菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性菌，属肠杆菌科耶尔森菌属，是肠道正常菌丛中的一种，在一定条件下可引起人和动物致病，引起胃肠道症状外，还能引起呼吸系统、心血管系统、骨骼结缔组织等疾患，甚至可引起败血症，造成死亡。该菌还是重要的食源性致病菌，很多国家都已将该菌列为进出口食品的常规检测项目。在传统的食品生产、质量监督和进出口检验检疫中常规的细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，检验周期长，同时对于有些细菌仍无法给出快速和准确的鉴定，不能完全满足农产品及进出口检验检疫的检测要求。基于核酸扩增的方法检测对象是来自病原微生物的DNA，经特异性扩增后进行产物鉴定，这类方法因灵敏度高，特异性好，耗时少而发展迅速。荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法，基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。公开号为 的专利技术专利“一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒”提供了一种利用TaqMan探针法进行小肠结肠炎耶尔森氏菌检测的引物和探针设计方法，“病原微生物检测用引物和使用所述引物的多重扩增”（公开号：CN101113475）同时设计了可检测霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血弧菌、沙门菌、志贺菌和李斯特菌的多条引物用于多重PCR，结果需要经凝胶电泳分析。实时定量PCR检测对设备依赖性强，难以实现现场检测，常规的PCR扩增检测需要对PCR产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗费时间较长，且难以保证检测的灵敏度。基因芯片方法在该北苑物的检测中也有运用，公开号为CN102311993 的专利技术专利“用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒”及公开号为CN102140507的专利技术专利“用于感染性腹泻的检测型基因芯片及检测用试剂盒”各自提供了用于基因芯片的引物设计和检测方法，但基因芯片的设备依赖性限制了其应用范围，并且往往需要预扩增技术，增加了实验流程。另一类检测方法是基于双抗体夹心的免疫学检测方法，其检测对象主要是蛋白质分子，竞争法检测的对象为小分子化合物和半抗原分子，这两种免疫学检测方法都可以用免疫胶体金试纸条的方法实现，是快速检测的常规方法，具有快速、简单、成本低廉的优点，广泛用于食品中毒素、病原微生物以及农药、抗生素残留的筛查。过去病原微生物的免疫学检测主要依据上述抗原与抗体的结合反应，用酶联免疫吸附（ELISA）方法或免疫胶体金胶体金试纸条或完成检测。在免疫胶体金检测中，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原一抗体一有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成肉眼可见的有色沉淀线，对蛋白的检测依赖高亲和力和高特异性抗体的获得，在病原物分析时因为基因编码的规律和简并规则，DNA较蛋白质更易于产生序列差异，这种差异也更易于准确检出，通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率，通过在PCR扩增引物中引入特殊的标记物就可以实现双链产物的免疫学检测。如上所述，通过将PCR扩增使用的引物标记特定的蛋白质或化合物可以在其扩增产物中引入同时包括两种化合物/蛋白质标记的核酸复合物，这个标记的产物可以通过抗体或者配体以类似双抗体夹心的方式进行检测，这个过程类似常规的免疫金标记检测技术，这种方法已经在单核苷酸多态性以及恒温扩增靶基因的方法中使用，公开号为CN 102134596 A的专利技术专利-一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法即以此方法进行单核苷酸多态性的检测。而公开号为CN 102520172 A的专利技术专利-单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用描述了一种分别采用生物素和地高辛标记引物的单增李斯特菌检测方法。因此类方法仅对扩增产物的有无进行判断，不对产物的分子量确认，因此在扩增反应中的干扰因素更多一些，常见的引起假阳性的原因包括：非特异性扩增、引物二聚体、扩增产物间的异常复性，解决引物二聚体、异常退火造成的干扰可以从PCR聚合酶的选择、引物序列优化、dNTP底物、杂交过程的控制几个方面开展。选择具有热启动（Hot-start）功能的DNA聚合酶可以明显降低引物二聚体和非特异扩增产物的形成。在引物优化方面，公开号为CN 102146432 A的专利技术专利-“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”描述了一种在引物5′端带有短回文序列的引物设计方法，该引物常温下自身环化，避免形成异源二聚体，公开号为CN 102719547 A的专利技术专利-“检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂”也采用了类似的方法用于实时定量PCR的扩增；公开号为CN 101842494 A的专利技术专利-“使用嵌合引物降低异源二聚体形成”描述了一种使用嵌合引物进行扩增的方法；在对反应底物的优化中，公开号CN 101171343A的专利技术专利“含有假异胞口密院核碱基衍生物的3′修饰寡核昔酸及其作为引物或探针的应用”提供了一种使用特别修饰的核苷酸作为底物以减少引物二聚体形成的方法，使用探针或者引入内控探针也可以降低非特异扩增的干扰，公开号为CN 101957373 A的专利技术专利-“一种加入内控核酸对病原体核酸进行半定量检测的方法”即采用内控探针来降低干扰，上述方法中，使用热启动技术和环化引物是通行的方法，其余方法或者采用了特殊合成的底物及底物，或者需要通过探针引入第二次杂交过程，都会增加检测过程的复杂程度，特别是探针杂交方法，因需要保温过程而失去了试纸条方法的便利性。本专利技术引物设计中，在保持特异性基础上，对引物对及引物内5′及3′末端退火的自由能进行评估后选择合适的区域避免二聚体的形成，针对试纸条检测方法二聚体的干扰情况以适当的扩增子长度，配合展开缓冲液中去污剂及变性剂的浓度优化，可以实现引物二聚体和非特异扩增产物的有效清除。
技术实现思路
将生物小分子或化合物标记的核酸分子可以被该小分子或化合物的抗体特异性识别，从而通过免疫学方法检测。常见的可用于核酸分子标记的分子包括半抗原分子生物素（Biotin）、地高辛（Digoxin），荧光染料分子罗丹明(RBITC)、异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)、Cy3、Cy5等。上述标记分子中，地高辛、异硫氰酸荧本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.本发明提供一种食源性病原微生物-小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的试纸条快速检测方法。
2.如权利要求1所述的检测方法，采用两条独特设计的引物PCR进行扩增反
应，其中上游引物Ail-F的序列为：5′-TAATGTGTACGCTGCGAG-3′，下游引物Ail-R的序列为5′- GACGTCTTACTTGCACTG-3′，上游引物和下游引物的5’末端分别进行半抗原或荧光素分子标记。
3.如权利要求1所述的检测方法使用带有核酸变性剂的展开缓冲液完成试纸条上的层析，其成分为：10mM Tris、1% BSA、1% Tween 20以及浓度分别为0.05mol/L到0.5mol/L的Na...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑文杰，李宗梦，张宏伟，刘培，曲鹏，奚文辉，郝育杰，尹长城，刘斯奇，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：
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