本发明专利技术公开了一种鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型的共显性标记引物组及其应用，所述共显性标记引物组的碱基序列分别如SEQ ID NO.4～7所示。本发明专利技术还提供了所述的共显性标记引物组在鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型中的应用。本发明专利技术的共显性标记引物能够特异性的对水稻基因组DNA进行标记鉴定，检测水稻材料基因组DNA中p/tms12-1的等位基因类型，检测的准确性高，与传统的酶切和测序的方法相比，具有成本低、操作简单的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学及水稻育种领域，涉及一种鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型的共显性标记引物组及其应用。
技术介绍
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，通过两系法及三系法培育杂交水稻新品种、提高水稻产量一直是水稻育种学家的重要目标。利用光温敏不育系培育的两系杂交水稻免除了保持系，在不同的光温条件下既可以作为不育系与恢复系杂交制种，又可以自身繁殖，从而简化了繁种制种程序，降低了杂交种子生产成本。更重要的是，两系杂交稻的配组较自由，选配到优良组合的机率较高。因此，两系杂交育种是我国在水稻杂种优势利用的重大突破。 两系法杂交稻培育的关键之一是光温敏核不育系的培育，现有的光温敏核不育系的培育多采用冷水串灌繁殖、温室控温控光及海南冬繁等繁殖方式，大面积生产应用中存在两大问题，一是水稻光温敏不育系不育起点温度漂变导致的制种不安全，不育系经3-4代繁殖，不育系中部分植株的不育起点温度会上升，繁种产量越低，不育起点温度上升越快。生产中由于不育系不育起点温度上漂而导致制种失败或种子纯度不达标的事件经常出现。二是水稻光温敏不育系繁殖安全性差、产量低、质量不好。因此，开发新的水稻光温敏核不育系的选育方法，加速不育系选育周期及制种质量，对两系杂交水稻的快速发展具有重要意义。 近来我国科学家成功克隆了控制水稻光温敏核不育基因p/tms12-1，p/tms12-1是一个非编码RNA基因，它的原始转录本经过至少2次加工产生一个小RNA。与正常水稻品种相比，温敏不育水稻在该小RNA序列内存在一个单碱基突变（第789位碱基C→G的突变），这个单碱基突变是在籼稻产生温敏不育性和在粳稻产生光敏不育性的共同原因(Ding et al. PNAS,2012,109:2654-2659；Zhou et al.Cell Research,2012,22:649-660)。在正常水稻中，野生型P/TMS12-1的表达抑制了温敏或光敏不育的发生。而温敏和光敏不育水稻中，p/tms12-1的该突变影响了小RNA的表达水平及其可能与靶基因的互作能力而产生雄性不育。 水稻p/tms12-1基因的克隆为水稻光温敏核不育系的分子标记辅助选择育种提供了技术基础，能够帮助育种家加快不育系的选育过程，因此，在水稻育种上具有重要的利用价值。在利用含有p/tms12-1的光温敏核不育基因的不育系来配制杂交组合选育水稻不育系的过程中，单纯通过育性鉴定来选育不育系通常需要海南加代，育种周期较长。同时，目前广为应用的“培矮64S”等不育系存在一个明显的问题，即随着种植时间的增加，该品种的“不育起点温度”逐年增加，给育种带来了很大的风险，而导致这一问题的原因尚不清楚。通过p/tms12-1基因的分子标记筛选，有助于确认控制水稻温敏性状的具体基因序列，借助分子生物学手段解决“培矮64S”等不育系不育起点温度逐年增高的问题，使其育种价值大大提高。 在利用p/tms12-1进行水稻不育系的育种过程中，其杂交或回交后代中会分离出该基因的不同基因型单株，这就需要对杂交或回交后代植株进行单株基因型的检测，选择出p/tms12-1纯合或杂合的单株，用于随后进一步的回交或自交。由于在DNA序列上，p/TMS12-1和其等位基因p/tms12-1仅存在单个核苷酸的差异，在检测p/tms12-1基因时，通常使用PCR对p/tms12-1或p/TMS12-1基因进行扩增后，用限制性内切酶RsaⅠ对扩增产物进行酶切后电泳（如公开号为CN103146696A的中国专利文献所涉及的方法），或者对扩增产物进行直接测序的方法，去检测p/tms12-1或p/TMS12-1基因。但是，酶切和测序的两种方法耗时太长、且成本较高。 因此，有必要开发水稻光温敏核不育基因(p/tms12-1)/(p/TMS12-1)的共显性标记，将其用于光温敏核不育基因p/tms12-1的分子鉴定，以达到缩短不育系育种周期，简化操作步骤、降低检测成本等目的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种共显性标记引物组，特异性好，能够准确、快速的鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1的等位基因类型。 一种共显性标记引物组，由四条引物组成，所述四条引物的碱基序列 分别为： PTGMS-F1：5’-CTTGCTACCACAAGCTTTCC-3’； PTGMS-F2：5’-AGCAAAGAAGTGCATTGTTTGCGT-3’； PTGMS-R1：5’-TCCTTCTGGACTAGGAGCAA-3’； PTGMS-R2：5’-AAATTTTACTCTTGATGGATGGTGG-3’。 p/tms12-1基因内第789位碱基C→G的突变造成了水稻的光温敏雄性不育，本专利技术针对该SNP位点设计了上述的共显性标记引物组，其中，上游引物PTGMS-F2和下游引物PTGMS-R2处于SNP位点处，同时还对PTGMS-F2和PTGMS-R2的3’端碱基进行特殊设计，加大上游引物PTGMS-F2对基因p/TMS12-1的错配几率，提高其对基因p/tms12-1的特异性，加大下游引物PTGMS-R2对基因p/tms12-1的错配几率，提高其对基因p/TMS12-1的特异性。另外，由于上述四条引物可在同一体系中进行PCR扩增，并利用该四条引物之间的不同组合扩增出三种DNA片段，因此，本专利技术在设计时，还保证了上游引物PTGMS-F1分别与下游引物PTGMS-R1、下游引物PTGMS-R2的匹配性，以及下游引物PTGMS-R1分别与上游引物PTGMS-F1、上游引物PTGMS-F2的匹配性。 本专利技术还提供了所述的共显性标记引物组在鉴别水稻光温敏核不育基因p/tms12-1等位基因类型中的应用。 所述应用具体包括： （1）取待检测水稻样品的组织，提取DNA； （2）以所述的DNA为模板，利用如权利要求1所述的共显性标记引物组进行PCR扩增，获得PCR扩增产物； （3）对所述的PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果进行判断： 若所述的电泳结果在497bp和227bp处显示特异性条带，则待检测水稻样品含有等位基因p/tms12-1； 若所述的电泳结果在497bp和317bp处显示特异性条带，则待检测水稻样品含有等位基因p/TMS12-1； 若所述的电泳结果在497bp、317bp和227bp处显示特异性条带，则待检测水稻样品同时含有等位基因p/tms12-1和p/TMS12-1。 所述水稻样品可以为在利用p/tms12-1进行水稻不育系的育种过程中任意的杂交、回交后代植株。 提取DNA时，可以采用水稻的种子、叶片、根、花器等组织。对水稻DNA的提取方法也没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、ROSE一管法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒进行DNA的提取。 所述PCR扩增的体系和条件影响鉴别的准确性。 所述PCR扩增的体系较优的为：10×P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种共显性标记引物组，由四条引物组成，其特征在于，所述四条引物的碱基序列分别为：PTGMS‑F1：5’‑CTTGCTACCACAAGCTTTCC‑3’；PTGMS‑F2：5’‑AGCAAAGAAGTGCATTGTTTGCGT‑3’；PTGMS‑R1：5’‑TCCTTCTGGACTAGGAGCAA‑3’；PTGMS‑R2：5’‑AAATTTTACTCTTGATGGATGGTGG‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种共显性标记引物组，由四条引物组成，其特征在于，所述四
条引物的碱基序列分别为：
PTGMS-F1：5’-CTTGCTACCACAAGCTTTCC-3’；
PTGMS-F2：5’-AGCAAAGAAGTGCATTGTTTGCGT-3’；
PTGMS-R1：5’-TCCTTCTGGACTAGGAGCAA-3’；
PTGMS-R2：5’-AAATTTTACTCTTGATGGATGGTGG-3’。
2.如权利要求1所述的共显性标记引物组在鉴别水稻光温敏核不育
基因p/tms12-1等位基因类型中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：
（1）取待检测水稻样品的组织，提取DNA；
（2）以所述的DNA为模板，利用如权利要求1所述的共显性标记引
物组进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
（3）对所述的PCR扩增产物进行电泳，根据电泳结果进行判断：
若所述的电泳结果在497bp和227bp处显示特异性条带，则待检测水
稻样品含有等位基因p/tm...
【专利技术属性】
技术研发人员：李军，李白，高荣村，
申请(专利权)人：浙江省嘉兴市农业科学研究院所，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。