水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法技术

本发明专利技术提供一种水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法。采用转基因方法成功创造出了转基因水稻细胞质雄性不育种质，继而与同源或异源保持系进行核置换回交，选育出质核同源和异源的雄性不育系。按照本发明专利技术方法选育的细胞质雄性不育系所用的外源基因为非全长Hcpdil5‑2a，来源于锦葵科木槿属植物红麻。由此选育的水稻细胞质雄性不育系是由转基因雄性不育种质与非转基因的同源或异缘保持系(或品种/系)进行了核置换回交而成，因而其细胞核为非转基因，不含转基因质粒载体，与非转基因植物无异，不存在安全风险和市场风险；同时也极大地丰富了水稻雄性不育细胞质的遗传多样性，具有极为广阔的应用前景。

Rice transgenic method for creating cytoplasmic male sterile line

The invention provides a method for rice genetically modified cytoplasmic male sterile line. The Transgenic Rice Cytoplasmic Male Sterile germplasm was successfully created by using transgenic method, and then the substitution of homologous or alien maintainer lines for nuclear substitution was carried out to select the male sterile line with plastid, nuclear, homologous and heterologous. The foreign gene in accordance with cytoplasmic male sterile line breeding method of the invention is a non full-length Hcpdil5 2a, derived from the Malvaceae Hibiscus plant kenaf. Cytoplasmic male sterile rice breeding which is composed of transgenic male sterile germplasm maintainer lines and non transgenic homologous or different margin (or cultivars) were backcrossed into nucleus replacement, so the nuclear non GMO, no genetically engineered plasmid vector, is no different from non transgenic plants, there is no security risk and market risk at the same time; also greatly enriched the genetic diversity of rice male sterile cytoplasm, has very broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法
本专利技术涉及生物技术和植物育种
，具体地说，涉及一种水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法。
技术介绍
水稻细胞质雄性不育(CytoplasmicMaleSterility，CMS)种质创新是杂种优势利用的基础。目前，在生产上利用的水稻雄性不育种质资源主要是从自然界发现的突变体或远缘杂交后代产生，由此选育出的细胞质雄性不育系均为细胞质和细胞核源于不同类型或不同品种的质核异源细胞质雄性不育系，尚未见到选育出细胞质和细胞核均源于同一品种(系)的质核同源雄性不育系的报道。而且，由于自然CMS种质有限，远缘杂交难以成功以及细胞质母性遗传等因素，又限制了杂交种产量的持续提高，并存在单一细胞质杂交种大面积推广存在的某一生理小种大范围存在的风险。由于转基因具有不受物种限制的特点，而且栽培品种的细胞质资源比一般野生种资源丰富，若能将栽培品种细胞质的遗传多样性和转基因技术相结合选育CMS系，将极大地扩大CMS的细胞质来源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法，可同时选育出质核异源和质核同源细胞质雄性不育系。本专利技术人长期致力于植物雄性不育种质创新及其分子基础的研究工作。2008年，由周瑞阳教授指导的博士研究生李刚采用同重标签相对定量与绝对定量(简称iTRAQ)技术分析了红麻雄性不育系和保持系花药线粒体蛋白质组差异，发现了一个差异表达的PDIL(proteindisulfideisomerase-like，类蛋白质二硫键异构酶，缩写为“PDIL”)蛋白。该蛋白质部分氨基酸残基的同源序列比对结果表明，其与AtPDIL5-2、OsPDIL5-2和OsPDIL5-3直系同源。2010年，由周瑞阳教授指导的另一位博士研究生金刚在此基础上，根据GenBank中公布的OsPDIL5-2、OsPDIL5-3、AtPDIL5-2及其他同源基因的cDNA序列，基于同源克隆和RACE技术，克隆了两个红麻PDIL同源基因，并通过全长cDNA的扩增加以验证。两个基因分别命名为Hcpdil5-2a和Hcpdil5-2b，在NCBI基因数据库中的登录号分别为HQ638208和HQ898859。同时，这两个基因在不育系开花期的不同组织器官的表达量存在差异，其中Hcpdil5-2a在各组织的表达均受到不育胞质的影响，而其Hcpdil5-2b的表达仅在营养器官中受到不育胞质的影响。说明Hcpdil5-2a可能与雄性不育有关。然而，与雄性不育相关基因的发现，与细胞质雄性不育系的创制是两个截然不同的问题。经过多年研究，本专利技术人采用花粉管通道法转红麻非全长Hcpdil5-2a基因，成功创造出了水稻细胞质雄性不育种质，继而转育成水稻细胞质雄性不育系。为了实现本专利技术目的，本专利技术水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法，包括以下步骤：S1、重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建将从红麻中克隆获得的Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列插入到PBI121-GFP载体的XbaI和KpnI酶切位点之间，即构建得到重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP；S2、转基因水稻植株的构建采用花粉管通道法将重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP导入水稻植株中，收获转基因水稻植株的T0代种子；S3、转基因水稻细胞质雄性不育种质资源的获得播种上述T0代种子获得T1代植株，于开花期调查T1代植株育性，选择雄性不育株，作为水稻细胞质雄性不育种质资源；S4、水稻转基因细胞质雄性不育系的选育(1)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之一：以上述转基因雄性不育种质资源为母本，以其野生型非转基因品种或品系回交，成熟期收获T1代种子，然后播种，观察T2代植株育性，如果仍表现为雄性不育，表明其为细胞质遗传的雄性不育，继续与原回交亲本进行核置换饱和回交所得的雄性不育系，即为质核同源细胞质雄性不育系，其野生型非转基因品种或品系即为该不育系的保持系；(2)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之二：以转基因质核异源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与不育株原始来源相同的野生型非转基因品种或品系杂交，并与该亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，也属于质核同源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系；(3)转基因质核异源细胞质雄性不育系的选育：以上述转基因雄性不育种质或转基因质核同源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与其异源保持系或常规品种或品系杂交，并与回交亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，即为质核异源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系。本专利技术中，所述异源保持系是指与转基因材料没有亲缘关系的雄性不育保持系或常规品种(系)。本专利技术中，同源保持系是指与转基因材料为同一来源的非转基因野生型保持系或品种(系)。本专利技术中，所述红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。前述的方法，步骤S2具体如下：S21、选择受体材料：选择生长健壮、无病虫害的水稻保持系植株；S22、质粒转化：在开花时期的晴天上午，选取当天已经开花授粉的颖花，用剪刀剪掉一半左右的颖壳，减掉柱头后，用微量注射器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒溶液，每次注射质粒直至将剩余一半颖壳装满，然后用杂交袋套好；S23、收获：待上述注入PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒的水稻植株果实成熟后，收集的种子即为T0代种子。在本专利技术中，所述核置换回交的回交世代数不低于5-6代。本专利技术所述水稻保持系包括但不限于水稻保持系M2B等。所述异源保持系选自以下水稻雄性不育保持系：中九B、内香B等。本专利技术采用转基因方法成功创造出了转基因水稻细胞质雄性不育种质，继而与同源或异源保持系进行核置换回交，选育出了质核同源和异源的雄性不育系。本专利技术以栽培品种为转基因供体，由此选育的雄性不育系为栽培品种细胞质雄性不育系。由于栽培种的进化程度高于野生种，有利基因多，因此，利用栽培品种细胞质雄性不育系有利于组配出制强优势组合；同时，也避免了农业生产上由于单一细胞质杂交种的大面积推广和长期利用可能导致的某一病害大流行的潜在风险。按照本专利技术方法选育的细胞质雄性不育系，经分子生物学鉴定表明，不含转基因质粒载体，与非转基因植物无异，不存在安全风险和市场风险，具有极为广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建流程示意图。图2为本专利技术实施例6中水稻转非全长Hcpdil5-2a基因创制细胞质雄性不育系的技术路线图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用本文档来自技高网...

【技术保护点】
水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、重组表达载体PBI121‑Hcpdil5‑2a‑GFP的构建将从红麻中克隆获得的Hcpdil5‑2a基因非全长CDS序列插入到PBI121‑GFP载体的Xba I和Kpn I酶切位点之间，即构建得到重组表达载体PBI121‑Hcpdil5‑2a‑GFP；S2、转基因水稻植株的构建采用花粉管通道法将重组表达载体PBI121‑Hcpdil5‑2a‑GFP导入水稻植株中，收获转基因水稻植株的T

【技术特征摘要】
1.水稻转基因创制细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建将从红麻中克隆获得的Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列插入到PBI121-GFP载体的XbaI和KpnI酶切位点之间，即构建得到重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP；S2、转基因水稻植株的构建采用花粉管通道法将重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP导入水稻植株中，收获转基因水稻植株的T0代种子；S3、转基因水稻细胞质雄性不育种质资源的获得播种上述T0代种子获得T1代植株，于开花期调查T1代植株育性，选择雄性不育株，作为水稻细胞质雄性不育种质资源；S4、水稻转基因细胞质雄性不育系的选育(1)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之一：以上述转基因雄性不育种质资源为母本，以其野生型非转基因品种或品系回交，成熟期收获T1代种子，然后播种，观察T2代植株育性，如果仍表现为雄性不育，表明其为细胞质遗传的雄性不育，继续与原回交亲本进行核置换饱和回交所得的雄性不育系，即为质核同源细胞质雄性不育系，其野生型非转基因品种或品系即为该不育系的保持系；(2)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之二：以转基因质核异源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与不育株原始来源相同的野生型非转基因品种或品系杂交，并与该亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，也属于质核同源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系；(3)转基因质核异源细胞质雄性不育系的选育：以上述转基因雄性不育种质或转基因质核同源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与其异源保持系或常...

【专利技术属性】
技术研发人员：周瑞阳，汤丹峰，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45