本发明专利技术涉及肠道病原菌中耶尔森菌属的小肠结肠耶尔森菌的分离和鉴定方法，主要解决现有小肠结肠耶尔森菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。试剂盒，包括：1）通用型非选择性增菌液；2）10倍浓缩通用型非选择性增菌液；3）耶尔森菌冷增菌液；4）耶尔森菌快速选择性增菌液；5）选择性分离平板；6）产毒性小肠结肠耶尔森菌显色琼脂平板；7）小肠结肠耶尔森菌生化鉴定管配方；8）硫化氢滤纸条；9）吲哚滤纸条。利用选择性增菌、选择性分离培养基对应生长的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验筛选、鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肠道病原菌中耶尔森菌属的小肠结肠耶尔森菌的分离和鉴定方法，特别涉及利用选择性增菌、选择性分离培养基对应生长的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验筛选、鉴定包括多种复杂生物型和产毒或非产毒血清型在内的小肠结肠耶尔森的试剂盒、制备和应用。
技术介绍
小肠结肠耶尔森菌广泛分布在自然界中，在野生动物和家养的偶蹄动物中(尤其是猪)体内(包括淋巴系统和循环、肠道等部位)寄生或定殖，属于目前已知的动物类肉类制品明确检疫的病原菌，同时，也是能引起食源性传播和暴发 的重要病原菌之一。国内的许多实验室(包括临床实验室和公共卫生实验室)在实际工作中无法通过可选择的常规微生物分离方法和材料达到分离的预期效果，反而受制于培养基的批间质控要求繁琐、敏感性和特异性低以及多次对疑似菌落筛选和鉴定所用自动化生化反应试剂材料的昂贵费用，费工费时。本专利技术是基于传统细菌学技术简化，经提炼、加入创新材料组合成的检测程序，包括对多种复杂样品的预处理和选择性增值，使用选择性平板分离出所有小肠结肠耶尔森菌的典型菌落，结合简易生化和特异性酶-底物反应组合试验同时筛选、鉴定产毒性小肠结肠耶尔森菌的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的传统分离平板和鉴定技术单纯依赖自动化生化鉴定仪器为主的方法更具有综合成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点。适用粪便(或者粪便拭子)、食品、环境水样等多种增菌标本中小肠结肠耶尔森菌的同步分离和鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可利用产毒性小肠结肠耶尔森菌的生物学特性和酶反应试验鉴定的试剂盒、制备和应用。主要解决现有小肠结肠耶尔森菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。本专利技术针对不同类型标本分别使用2种选择性增菌液及专一性分离平板配合简单的糖生化发酵-动力反应模式和细菌特异性酶-底物反应特征建立一套行之有效的分离和特异性鉴别试验，达到对产毒性小肠结肠耶尔森菌分离、筛选和简易鉴定的效果。本专利技术的技术方案为小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定的试剂盒及其制备方法，包括 I、通用型非选择性增菌液胰酪胨大豆胨肉汤(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17. 0g，植物蛋白胨3. Og,氯化钠5. Og,K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水1000ml,加热溶解后矫正pH至7. 3±0. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅15分钟(121°C)灭菌后分装225ml/瓶备用。2、10倍浓缩通用型非选择性增菌液胰酪胨大豆胨肉汤(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17. Og,植物蛋白胨3. Og,氯化钠5. Og, K2HPO4 2. 5g，葡萄糖2. 5g，蒸馏水IOOml，加热溶解后矫正pH至7. 3±0. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅15分钟(121°C)灭菌后分装IOml/瓶备用。3、耶尔森菌冷增菌液蛋白胨山梨醇胆盐肉汤动物组织胰化胨5.0g，山梨醇10. Og,磷酸氢二钠8. 23g,磷酸二氢钠I. 2g,混合胆盐I. 5g,氯化钠5. Og,加热溶解后矫正pH至7. 6±0. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅15分钟(121°C )灭菌后分装IOml/管备用。4、耶尔森菌快速选择性增菌液替卡西林高氯酸肉汤(TCB)。成分氯化镁(含6H20) 60. 0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，氯化钠5. 0g，高氯酸I. 0g，酵母浸出物1.0g，2%质量百分浓度的孔雀石绿5. 0ml，三氯生溶液(用质量百分浓度95%的乙醇配成质量百分浓度O. 1%的溶液)I. 0ml，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7. 6±0. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅15分钟(121°C)灭菌冷却至50°C后加入替卡西林(羟噻吩青霉素，O. 1%质量百分浓度水溶液)I. 0ml，分装IOml/管备用。 5、选择性分离平板(CIN):成分琼脂12. 5g，甘露醇20. 0g，胰化酪蛋白胨20. Og,酵母浸出物3. Og,氯化钠I. Og,丙酮酸钠2. Og,去氧胆酸那2. Og,硫酸镁0. Olg置950ml蒸馏水加热溶解煮沸，矫正PH至7. 4±0. I (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅15分钟(121°C)灭菌后冷却至80°C加入三氯生溶液(用95%质量百分浓度的乙醇配成0. 4%质量百分浓度的溶液)Iml,混勻，继续冷却至50°C加入中性红(3mg/ml) 10ml,结晶紫(0. Img/ml) 10ml,头孢噻吩(I. 5mg/ml) 10ml,新生霉素(0. 25mg/ml) 10ml,最后不断搅拌,加入10%质量百分浓度的氯化锶溶液IOml后倾注无菌平皿，置冰箱中，备用。6、产毒性小肠结肠耶尔森菌显色琼脂平板(CYA):成分琼脂15. 0g，脑心浸液肉汤干粉25g，植物蛋白胨3. 0g. Og,酵母浸出物6. Og,丙酮酸钠2. 0g, D-纤维二糖20g，置950ml蒸馏水加热溶解煮沸，矫正pH至7. 4 ±0. I (按冷却至25 °C后测量值为标准)。冷却至80°C加入酶显色底物5_溴-4-氯-3-吲哚-β-D-卩比喃半乳糖苷(X-Glc，IMTris. HClpH8. O溶解)150mg，5ml ；X-^-glc (N_N_ 二甲基甲酰胺溶解)200mg，5ml和三氯生溶液(用95%质量百分浓度的乙醇配成0. 4%质量百分浓度的溶液)1ml，混匀，继续冷却至50°C加入中性红(3mg/ml) 10ml,结晶紫(0. lmg/ml) 10ml,头孢磺唳(0. 5mg/ml) 10ml,万古霉素(lmg/ml)10ml,最后不断搅拌后倾注无菌平皿,置冰箱中，备用。7、小肠结肠耶尔森菌生化鉴定管配方 第一管成分琼脂14. Og,牛肉膏2. Og,酵母浸出物2. Og,葡萄糖I. Og,蛋白胨15. Og,甘露醇10. 0g，尿素10. Og, 0. 2%质量百分浓度的麝香草酚蓝溶液IOml，0. 2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液12. 5ml, 0. 2%质量百分浓度的甲酚红溶液4ml，蒸馏水1000ml ； 第一管配制 1)、取琼脂14.0g、牛肉膏2. Og及蒸馏水1000ml，混合后加热溶解，并用数层纱布过滤； 2)、再取酵母浸出粉2.0g、葡萄糖I. 0g、蛋白胨15. 0g、甘露醇10. Og及尿素10. Og,混入已溶解的琼脂中。充分摇匀，使全部溶解。再加入15%质量百分浓度的氢氧化钠约I. 5ml,矫正pH至7. I (按冷却至25°C后测量值为标准)； 3)、然后加入指示剂0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液12. 5ml,0. 2%质量百分浓度的甲酚红溶液4ml、0. 2%质量百分浓度麝香草酚蓝溶液IOml ；4)、混合后,充分摇勻。分装于13XIOOmm的试管内，每管约3ml ； 5)、置高压灭菌器内，经10磅10分钟的灭菌； 6)、灭囷后,制成斜面,底部宜厚。待凝固后，直于冰箱中，备用； 表I指示剂所需量及其配制指示剂名称I所需重量I加N/20氢氧化钠溶液I蒸馏水量I敏感范围(pH) I色泽改变(酸一碱)溴麝本文档来自技高网...
【技术保护点】
小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定的试剂盒，包括：1）、通用型非选择性增菌液：成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4？2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml；2）、10倍浓缩通用型非选择性增菌液：成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4？2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水100ml；3）、耶尔森菌冷增菌液：蛋白胨山梨醇胆盐肉汤：动物组织胰化胨5.0g，山梨醇10.0g，磷酸氢二钠8.23g，磷酸二氢钠1.2g，混合胆盐1.5g，氯化钠5.0g；4）、耶尔森菌快速选择性增菌液：成分：氯化镁60.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，高氯酸1.0g，酵母浸出物1.0g，2%质量百分浓度的孔雀石绿5.0ml，三氯生溶液1.0ml，蒸馏水1000ml，替卡西林1.0ml；5）、选择性分离平板：成分：琼脂12.5g，甘露醇20.0g，胰化酪蛋白胨20.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠1.0g，丙酮酸钠2.0g，去氧胆酸那2.0g，硫酸镁0.01g，蒸馏水950ml，三氯生溶液1ml，中性红10ml，结晶紫10ml，头孢噻吩10ml，新生霉素10ml，氯化锶溶液10ml；6）、产毒性小肠结肠耶尔森菌显色琼脂平板：成分：琼脂15.0g，脑心浸液肉汤干粉25g，植物蛋白胨3.0g.0g，酵母浸出物6.0g，丙酮酸钠2.0g，D？纤维二糖20g，蒸馏水950ml，5？溴？4？氯？3？吲哚？β？D？吡喃半乳糖苷150mg，X？β？glc？200mg，三氯生溶液1ml，中性红10ml，结晶紫10ml，头孢磺啶10ml，万古霉素10ml；7）、小肠结肠耶尔森菌生化鉴定管配方：第一管成分：琼脂14g，牛肉膏2g，酵母浸出粉2g，葡萄糖1g，蛋白胨15g，甘露醇10g，尿素10g，0.2%质量百分浓度的麝香草酚蓝溶液10ml，0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，0.2%质量百分浓度的甲酚红溶液4ml，蒸馏水1000ml；第二管成分：琼脂3g，胰蛋白胨10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，10%质量百分浓度的Na2HPO42.5ml，蔗糖10g，1%质量百分浓度的硫代硫酸钠溶液2.5ml，0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液5ml，蒸馏水1000ml；8）、硫化氢滤纸条；9）、吲哚滤纸条。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许学斌，袁政安，金汇明，
申请(专利权)人：上海市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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