检测恶疫霉菌的特异性引物及PCR检测方法和应用技术

本发明专利技术提供了检测恶疫霉菌的特异性引物及PCR检测方法和应用。所述引物包括上游引物PCAF：5'‑AGCAGACGTGGCGTGTTT‑3'和下游引物PCAR：5'‑TACACACGTTGGACGCACCT‑3'，在所述引物的基础上建立恶疫霉菌PCR检测方法，可在恶疫霉菌菌株纯培养物DNA、被恶疫霉菌侵染的苹果果实组织和携带恶疫霉菌土壤的DNA中特异性地扩增出片段大小为211bp的单一条带。本发明专利技术的检测方法操作简便、耗时少、准确性高、特异性强、灵敏度高，可用于恶疫霉菌引起病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农作物病害预警检测、鉴定及防治
，涉及一种分子快速检测的方法与应用，具体涉及一种检测恶疫霉菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用。
技术介绍
恶疫霉(PhytophthoracactorumSchroet)是世界范围内广泛分布的重要植物病原菌之一，能侵染约60个科、50个属中的200多种植物，所引起的植物病害分布广泛，是导致多种经济作物（如草莓、苹果、梨和人参等）发生疫病的重要病原菌，如恶疫霉引起的草莓果腐病，是草莓结果中后期的一种常见病害，果实受害率一般在5%-15%，严重的甚至达到30%以上，对草莓的产量影响很大。恶疫霉菌通常以菌丝体和卵孢子在病残体和土壤中越冬，在条件适宜时菌丝直接侵染寄主，或形成大量游动孢子囊传播到地上部侵染寄主，其侵染引起的植物疫病是一种世界性分布的土传毁灭性病害。目前对该病害还没有快速有效的防治措施，控制该病的最有效途径就是加强检疫，防止病原菌的传播和阻碍其扩散方式。所以建立恶疫霉的快速分子检测技术对于其引起疫病的早期控制具有重要意义。恶疫霉菌的传统分类鉴定是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等对菌株进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状时行判定。传统方法在恶疫霉菌检测中发挥了重要作用，但传统分类鉴定方法费时费力、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验，最重要一点是不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学技术的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的途径，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功案例已越来越多。目前，国内外研究人员主要利用rDNA/ITS基因、elicitin基因、β-tubulin基因、线粒体Cox1和Cox2编码基因以及可能编码储存蛋白的Lpv基因等作为检测靶标序列，根据基因序列在不同病原菌种之间的差异位点，设计检测对象（病原菌）的特异性PCR引物来进行快速检测、鉴定。然而疫霉属卵菌不同种之间在形态学和基因序列上相性以很大，有的分子PCR检测靶标基因序列在疫霉属的近缘种之间变化很小。例如，从ITS序列上设计引物很难将两个相似高的疫霉种区分开。因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，首先应筛选出在疫霉菌不同种之间序列差异较大的基因作为检测靶标，然后再进行引物设计和检测。近期已有研究表明，疫霉属中的Ypt1基因含有多个外显子和内含子，外显子具有保守性，而这些内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的特异性分子检测、鉴定，目前尚无针对该靶标基因设计的特异性引物PCR检测恶疫霉菌的报道。本专利技术以Ypt1基因为恶疫霉菌检测靶点，设计特异引物并与PCR技术相结合，建立特异性强、灵敏度高、耗时短的检测方法。该方法在恶疫霉菌的种类鉴定、监测和病害及时防控等方面具有一定的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测恶疫霉菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用，针对现有技术中对恶疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有分子检测中rDNA-ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将一些近缘种的病原菌区分开的技术缺欠，提供了一种检测恶疫霉菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用，本专利技术可以直接从发病的植物组织和带菌土壤中检测出恶疫霉菌。本专利技术所述的恶疫霉菌快速分子检测方法可用于恶疫霉菌引起病害的早期诊断及病菌的监测和鉴定中，本专利技术对恶疫霉菌检测可达到准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠的目的。实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用下列步骤（技术方案）予以实现：1.通过测定恶疫霉菌（Phytophthoracactorum）和其它疫霉菌（Phytophthoraspp）的Ypt1基因序列，对疫霉属不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出对恶疫霉菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物的序列为：上游引物PCAF：5'-AGCAGACGTGGCGTGTTT-3'，下游引物PCAR：5'-TACACACGTTGGACGCACCT-3'；对恶疫霉菌特异性扩增出211bp的产物。2.恶疫霉菌特异PCR检测方法的建立，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA。用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µL2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%CTAB；100mmol/LTris-HCl,pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl）和90µLSDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000r·min-1离心15min；取上清液700µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min-1离心9min；取上清液500µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min-1离心5min；取上清液350µL，加入1/10体积3mol·L-1NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min-1离心5min；弃去上清液，加入700µL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60µLTE（10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/LEDTA，pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng/µL待用。用于检测植物组织中存在恶疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL0.5mol/LNaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µL0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0µL作为PCR模板进行扩增；用于检测土壤样品中存在恶疫霉菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，利用PCAF/PCAR这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系25µL，包括2×TaqPCRMasterMix（北京天根生化科技有限公司）12.5µL，10µmol/L的PCAF/PCAR引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25µL；扩增参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。（3）取步骤（2）的PCR扩增产物5.0µL用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，4-5V/cm，电泳40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约211bp的单一条带，即可判断本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测恶疫霉菌的特异性引物，其特征在于，所述引物的序列为：上游引物PCAF：5'‑AGCAGACGTGGCGTGTTT‑3'，下游引物PCAR：5'‑TACACACGTTGGACGCACCT‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种检测恶疫霉菌的特异性引物，其特征在于，所述引物的序列为：上游引物PCAF：5'-AGCAGACGTGGCGTGTTT-3'，下游引物PCAR：5'-TACACACGTTGGACGCACCT-3'。2.根据权利要求1所述检测恶疫霉菌的特异性引物，其特征在于，所述上游引物PCAF和下游引物PCAR对恶疫霉菌特异性扩增出211bp的单一条带。3.利用权利要求1所述的特异性引物检测恶疫霉菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）待测样品基因组DNA的提取；（2）PCR方法的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的PCAF/PCAR引物进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为：PCR反应体系25µL，包括2×TaqPCRMaste...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰成忠，吴玮，阮宏椿，姚锦爱，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35