本发明专利技术提供用于检测淋巴瘤的引物组及其检测方法，本发明专利技术的引物包括SEQ ID No.1‑‑SEQ ID No.24，可对CK7、CK19、CK20等12个基因进行联合检测。通过PCR或荧光定量PCR的方法，可在短时间内灵敏检测出靶基因的表达及表达水平；采用优化的PCR条件，通过调整扩增反应的循环数，使观察结果更显著，进一步提高本发明专利技术方法的适用性；PCR扩增产物具有特异性，可确保PCR和荧光定量PCR检测高准确度和灵敏度。实施本发明专利技术中用于淋巴瘤检测的引物组，通过检测病人样本中靶点基因的表达，可以简单、方便且准确地诊断淋巴瘤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测淋巴瘤的引物组及检测方法。
技术介绍
淋巴瘤是起源于淋巴结和/或结外淋巴组织的恶性肿瘤，一般分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类，是成人恶性肿瘤中的常见类型。淋巴瘤通常以实体瘤形式生长，以无痛性进行性淋巴结肿大为特征，其临床表现可因受累部位不同而多种多样。目前针对淋巴瘤最主要的治疗方案为化疗、放疗。虽然上述方法可以改善患者的生存期，甚至可以使部分患者获得长期生存，但这两种方式均不能彻底清除肿瘤细胞，大部分患者最终仍可复发或病情进展。淋巴瘤作为一种恶化程度高、预后较差的恶性肿瘤，早期的诊断和治疗对于淋巴瘤患者是非常必要的。目前淋巴瘤的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括X射线、CT扫描、核磁共振检查等，但是其效率较低并且检测准确度不高。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者穿刺的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害。近来，循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。CTCs的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选方法通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获表面未表达肿瘤标记物的CTCs细胞。采用RT-PCR方法检测CTCs细胞中特异性基因是CTCs细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。目前采用RT-PCR方法检测淋巴癌CTCs的标准还没有完全建立。我们通过检测淋巴瘤患者的CTCs特征基因，确定淋巴瘤CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物，包括NK和CAR-T免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。针对上述问题，本专利技术开发一种高灵敏的多基因联合检测的试剂盒，通过联合检测CK7、CK19、CK20、C-Met、EGFR、MUC1、N-Cadherin、CD133、VEGF、VEGFR2、PDGFR和hTERT12个基因实现肿瘤的早期筛查或诊断。本专利技术设计运用靶向特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到95％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测淋巴瘤的引物组及检测方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测淋巴瘤的引物组，包含：本专利技术的引物组可通过以下两种方法实现淋巴瘤的检测。方法1：PCR方法(1)将权利要求1所述的12对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。方法2：荧光定量PCR方法(1)将权利要求1所述的12对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过设计特异性PCR引物，开发出用于淋巴瘤早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的PCR体系可对CK7、CK19、CK20、C-Met、EGFR、MUC1、N-Cadherin、CD133、VEGF、VEGFR2、PDGFR和hTERT基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测可使淋巴瘤检出率达到98％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性强，正常人或非淋巴瘤病人样本不会产生非特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。附图说明图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性PCR图。图2为实施例中非淋巴瘤外周血样本检测阴性PCR图。图3为实施例中非淋巴瘤组织样本检测阴性PCR图。图4为实施例中淋巴瘤患者外周血检测阳性PCR图。图5为实施例中淋巴瘤患者组织检测阳性PCR图。图中，M.100bpmarker；1.B2M；2.CK7；3.CK19；4.CK20；5.C-Met；6.EGFR；7.MUC1；8.N-Cadherin；9.CD133；10.VEGF；11.VEGFR2；12.PDGFR；13.hTERT。具体实施方式本专利技术针对目前肿瘤中主要的驱动性突变基因，联合检测CK7、CK19、CK20、C-Met、EGFR、MUC1、N-Cadherin、CD133、VEGF、VEGFR2、PDGFR、hTERT基因等12个基因实现淋巴瘤的早期筛查或诊断。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述12个基因的一整套特异性引物组。根据上述12个基因的参考序列设计特异性扩增引物，其PCR产物长度最优是在180-200bp之间，退火温度不高于60度，GC含量在40-60％之间，符合一般引物设计软件的要求。通过采用普通PCR或实时荧光PCR反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实施例1:基因选择多项研究表明，单基因筛查敏感度约为20-60本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测淋巴瘤的引物组，其特征在于，所述引物组可以包含a～l 12对引物，所述引物a的正向引物如SEQ ID No.1所示，引物a的反向引物如SEQ ID No.2所示，引物b的正向引物如SEQ ID No.3所示，引物b的反向引物如SEQ ID No.4所示，引物c的正向引物如SEQ ID No.5所示，引物c的反向引物如SEQ ID No.6所示，引物d的正向引物如SEQ ID No.7所示，引物d的反向引物如SEQ ID No.8所示，引物e的正向引物如SEQ ID No.9所示，引物e的反向引物如SEQ ID No.10所示，引物f的正向引物如SEQ ID No.11所示，引物f的反向引物如SEQ ID No.12所示，引物g的正向引物如SEQ ID No.13所示，引物g的反向引物如SEQ ID No.14所示，引物h的正向引物如SEQ ID No.15所示，引物h的反向引物如SEQ ID No.16所示，引物i的正向引物如SEQ ID No.17所示，引物i的反向引物如SEQ ID No.18所示，引物j的正向引物如SEQ ID No.19所示，引物j的反向引物如SEQ ID No.20所示，引物k的正向引物如SEQ ID No.21所示，引物k的反向引物如SEQ ID No.22所示，引物l的正向引物如SEQ ID No.23所示，引物l的反向引物如SEQ ID No.24所示。...
【技术特征摘要】
1.一种用于检测淋巴瘤的引物组，其特征在于，所述引物组可以包含a～l12对引物，所述引物a的正向引物如SEQIDNo.1所示，引物a的反向引物如SEQIDNo.2所示，引物b的正向引物如SEQIDNo.3所示，引物b的反向引物如SEQIDNo.4所示，引物c的正向引物如SEQIDNo.5所示，引物c的反向引物如SEQIDNo.6所示，引物d的正向引物如SEQIDNo.7所示，引物d的反向引物如SEQIDNo.8所示，引物e的正向引物如SEQIDNo.9所示，引物e的反向引物如SEQIDNo.10所示，引物f的正向引物如SEQIDNo.11所示，引物f的反向引物如SEQIDNo.12所示，引物g的正向引物如SEQIDNo.13所示，引物g的反向引物如SEQIDNo.14所示，引物h的正向引物如SEQIDNo.15所示，引物h的反向引物如SEQIDNo.16所示，引物i的正向引物如SEQIDNo.17所示，引物i的反向引物如SEQIDNo.18所示，引物j的正向引物如SEQIDNo.19所示，引物j的反向引物如SEQIDNo.20所示，引物k的正向引物如SEQIDNo....
【专利技术属性】
技术研发人员：徐以兵，寿鑫，童向民，蓝建平，朱珍芳，
申请(专利权)人：浙江大学，浙江省人民医院，上海博慷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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