一组莲藕InDel分子标记、其开发方法及应用技术

本发明专利技术公开了一组莲藕InDel分子标记、其开发方法及应用，该方法以藕莲品种齐头和子莲品种太空36的基因组重测序数据和中国古代莲参考基因组做比对，筛选三者间均有差异的InDel位点，设计PCR引物进行检测，根据引物在莲藕染色体上的位置挑选出一组46对引物，可应用于莲藕的遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析等研究，该方法开发的InDel多态标记具有成功率高、检测灵活、简易、成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子标记技术
，具体涉及一组莲藕InDel分子标记、其开发方法及应用。
技术介绍
莲藕(NelumbonuciferaGeartn)是莲科莲属多年生宿根性水生草本植物，是我国栽培面积最大的水生蔬菜。根据生产用途不同，莲可分为花莲、子莲和藕莲，藕莲和子莲的全国栽培面积分别为600万亩和150万亩左右。目前DNA分子标记已广泛应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等各个领域。莲藕分子标记的开发主要分为两个阶段：在莲基因组测序完成之前，最初的低通量分子标记开发需要研究者们从莲基因组中富集微卫星序列测序后开发SSR标记，或者使用RAPD标记和AFLP标记。随着高通量测序技术的发展和测序成本的大幅度降低，莲基因组测序及数据库极大地促进了莲藕分子标记的开发速度，近些年大量的SSR和SNP标记被开发，遗传连锁图谱也初步构建完成。SNP标记是一类新型分子标记，具有比普通分子标记密度高，分布均匀等优点，但由于受限于基因型分型技术，此类标记技术在小型和中型检测中成本高，操作复杂，且需要特殊的设备。目前基于PCR扩增和凝胶电泳的分子标记类型更适合于大部分实验室操作，这类标记中SSR是最常见的一类标记，此类标记的开发仅需根据样品中微卫星重复序列两侧序列设计引物即可，目前文献报道中的SSR标记一般是通过搜索某个品种基因组序列中微卫星重复序列获得，通过大批量设计引物后再针对某些特定研究品种进行多态性引物筛选，也就是说SSR标记使用前一般要进行很大一部分前期引物筛选工作。InDel标记是指由核苷酸水平上碱基的插入或缺失多态性，在植物基因组中有较高的分布频率，具有遗传稳定性高、分布广、多态性强等优点，并且InDel分布密度远高于SSR，理论上讲SSR标记包含在InDel标记范围内。随着基因组学及生物信息学的的发展，大量公共数据如EST、cDNA和基因组序列等信息大量出现，使得通过生物信息学方法可得到候选InDel成为可能，该类标记一个显著的优点在于基于多个品种DNA序列信息开发的品种间InDel多态标记成功率高，而且不需要类似SSR标记的多态引物筛选过程，工作效率显著提升，目前已在水稻、玉米、黄瓜、白菜等主要作物中得到广泛应用，但在莲藕中还没有相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于利用多个代表莲藕品种的基因组重测序数据开发多态性高的莲藕InDel分子标记，建立莲藕InDel标记开发的技术体系，为莲藕重要农艺性状基因的定位、遗传多样性分析、指纹图谱构建、全基因组关联分析与高密度遗传连锁图谱的构建和分子标记辅助选择育种提供更多新的InDel标记，弥补目前莲藕InDel标记较为缺乏的不足。本专利技术所述的莲藕InDel分子标记的开发方法，包括以下步骤：(1)利用IlluminaHiseq2500平台对藕莲品种齐头和子莲品种太空36进行基因组重测序，利用生物信息学软件进行数据分析，与参照基因组中国古代莲序列做比对，筛选三者间均有差异的InDel位点，结合引物设计软件大规模设计InDel标记引物；(2)挑选InDel长度差异相对较大的标记位点进行引物合成，挑选代表性莲藕品种进行引物检测筛选；(3)利用生物信息学分析对上述标记进行染色体定位，从中挑选染色体上均匀分布的标记。本专利技术利用Illumina基因组重测序技术对藕莲和子莲两个代表品种的基因组进行了重测序，与参照基因组中国古代莲序列做比对，筛选到三者间均有差异的InDel位点有634个并设计出标记引物，挑选出200个位点设计的引物进行验证，其中160对引物效果很好，通过对引物扩增区间进行染色体定位，筛选出一组标记位置均匀分布的46对引物(见表1)。表1.46对莲藕InDel分子标记引物序列该方法可应用于包括莲藕、荸荠、芡实、芋头在内的所有水生蔬菜InDel分子标记的开发。本专利技术所述的莲藕InDel分子标记在莲藕遗传图谱构建、QTL定位、分子辅助育种及遗传多样性分析中的应用。本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术针对莲藕三个不同类别代表品种的基因组差异开发的InDel多态标记具有很高的成功率，比起根据SSR位点设计的引物再筛选多态性具有更高的效率。(2)现有莲藕的高密度连锁图基本是由SNP标记构成，本专利技术开发的InDel标记检测方式更灵活、简易、成本低。(3)本专利技术的46对引物，在8个连锁群上分布均匀，用于莲藕重要农艺性状基因的定位、遗传多样性分析、指纹图谱构建、全基因组关联分析与遗传连锁图谱的构建或分子标记辅助选择育种，可以提高工作效率。附图说明图1为可以锚定到现有文献公布的遗传连锁图上的113对引物的相对遗传位置。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例子仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。为了提高莲藕InDel标记开发的成功率，本专利技术对莲藕主要类别中藕莲品种齐头和子莲品种太空36进行了基因组重测序，再和参考基因组中国古代莲基因组比对，筛选三者间均有差异的InDel位点进行标记开发。(1)莲藕样品重测序及数据分析样品基因组DNA检测合格后，用机械打断的方法(超声波)将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用IlluminaHiSeqTM2500进行测序。测序共获得19.67Gb的RawData，过滤后得到的CleanData为19.29Gb，Q30达到85.89％，平均每个个体测序深度为12X。样品与参考基因组平均比对率为88.74％，平均覆盖深度为9X，基因组覆盖度为97.10％(至少覆盖1X)。将CleanReads与参考基因组序列进行比对，基于比对结果进行SmallInDel的检测和注释，利用R语言结合Primer3.0引物设计软件，大规模设计InDel标记引物，产物长度200-350bp，退火温度56-60℃。最终得到两个样品和参考基因组三者间均有差异的InDel位点634个，设计引物634对。(2)筛选两个测序品种和参考基因组三者间均有差异的Indel位点，且差异相对较大的200对引物交上海生工公司合成。利用齐头、太空36和中国古代莲等8个代表样品对上述引物进行扩增效果评价。PCR反应体系为20μL：含有15.2μL双蒸水，2μL10×PCR缓冲液，正、反引物各0.6μL(10μm/L)，dNTP0.3μL(10mm/L)，0.3μLTaq酶(5U/μL)，1μLDNA模板。扩增反应PCR程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸60s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min。统计结果表明160对引物扩增效果良好、符合预期。(3)莲藕基因组测序虽已初步完成，但完整的物理图谱还没完成，现在仅把测序数据拼接成168个megascaffold和3166个scaffold，只分析各标记位点的物理位置信息还是不能很直观的展示其在整个基因组染色体上的分布情况。最新文献报道了莲藕高密度SNP标记绘制的遗传连锁图谱(Constructionofahigh-densit本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组莲藕InDel分子标记，其特征在于：所述InDel分子标记包括如下46个位点所对应的正向和反向引物：。

【技术特征摘要】
1.一组莲藕InDel分子标记，其特征在于：所述InDel分子标记包括如下46个位点所对应的正向和反向引物：。2.权利要求1所述的莲藕InDel分子标记的开发方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：1)利用IlluminaHiseq2500平台对藕莲品种齐头和子莲品种太空36进行基因组重测序，利用生物信息学软件进行数据分析，与参照基因组中国古代莲序列做比对，筛选三者间均有差异的InDel位点，结合引物设计软件大规模设计I...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴修，律文堂，李效尊，尹静静，徐国鑫，阴筱，
申请(专利权)人：山东省水稻研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37