一个用于鉴别双孢蘑菇菌株类型的ISSR标记及应用制造技术

本发明专利技术提供了一个鉴别双孢蘑菇G型菌株的ISSR标记及应用，G型菌株具有菇质结实、菌褐细小、不易褐变等特点，利用ISSR引物对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增，仅G型菌株能扩增出300bp特异片段。本发明专利技术的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇G型菌株,而不用经过出菇试验。该方法耗时短，操作简便，特异性强，可以在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴别菌株的不同类型，极大地提高了双孢蘑菇杂交育种的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食用菌DNA标记辅助育种领域，更具体涉及一个用于鉴别双孢蘑菇菌株类型的ISSR标记及应用。
技术介绍
双孢蘑菇是我国的大宗食用菌之一，2015年全国双孢蘑菇总产量达230多万吨，占世界年产量50%以上。据测算，每生产1吨鲜蘑菇，即可转化1吨养殖业废料和2吨种植业废料，解决1个农村劳动力就业，因此经济效益、社会效益和生态效益显著。根据双孢蘑菇的栽培农艺特性，结合酯酶同工酶表型分析，可把这些菌株区分为G型、H型、HG型等不同类型，其中G型菌株的优质特征明显，其菌盖圆整光滑、菇质结实、组织致密、菌褶细小色淡、不易褐变、制罐收缩率低。目前我国双孢蘑菇农业生产仍占到总量的80%以上，产品除鲜销外，部分还加工成罐头出口，因此所用的品种也要求以优质为主、兼顾产量的品种，如本单位选育的As2796、W192等品种。因此，具有优质性状的G型双孢蘑菇种质资源及新品种对我国的双孢蘑菇产业至关重要。目前本单位致力于通过DNA分子标记辅助育种技术进行双孢蘑菇新品种的选育，开发的DNA标记已应用到亲缘关系分析、杂交亲本选择、同核体鉴定等方面。ISSR(简单序列重复区间)是一种新发展起来的基于微卫星序列的DNA分子标记技术。它利用人工设计合成的核苷酸重复序列引物对SSR(简单序列重复)之间的DNA序列进行半随机PCR扩增，可获得丰富的多态性。本专利技术人通过大量的ISSR引物筛选和大规模的菌株验证，找到了一个能用于鉴别双孢蘑菇G型菌株的ISSR标记。利用该分子标记能在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴别G型菌株，而不必经过费时费力的出菇试验，这对杂交育种中亲本选择与跟踪鉴定、提高育种效率有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术基于分子标记技术，建立一个用于鉴别双孢蘑菇菌株类型的ISSR标记及应用。本专利技术为一个用于鉴别双孢蘑菇菌株类型的ISSR标记及应用，是利用ISSR分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增。利用ISSR引物对双孢蘑菇菌株基因组DNA进行ISSR-PCR，G型菌株能扩增出300bp的特异性条带，所述ISSR引物的核苷酸序列为：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGG-3’。所述引物在鉴别双孢蘑菇G型菌株上的应用。本专利技术的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇G型菌株，该方法耗时短，操作简便，特异性强，无需出菇，省时省力。根据特异性扩增产物300bp条带的有无来鉴定不同类型菌株，具有该条带的菌株为G型菌株，没有该条带的菌株为其它类型菌株。附图说明图1双孢蘑菇24个G型菌株的ISSR图谱，M:LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarkers；1-24：162-1，Δ32α，LMi，SA6，Ag5，832，78832，上20-1，F922，Somycel22，Psu310，310，M22，M91，虹桥22-2，日本Ag，0042，0045，沪103，福罐4，M-2，102N，Ag22，308-1。右边箭头指示特异条带位置，显示24个G型菌株均扩增出约300bp的特异条带。图2双孢蘑菇24个非G型菌株的ISSR图谱，M:LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarkers；25-48：102-2，苏锡一号，T-03，111-455，111，浣沙176，浣沙176-3，245-6，F4，F20，Ag6，8132D，02，7001，7601，701，Ag18，台-1，0072，S46，50-1，125，浣沙176-2，日本118。右边箭头指示特异条带位置，显示24个非G型的其它菌株均未扩增出约300bp的特异条带。具体实施方式实施例11.TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs购自厦门泰京生物有限公司，ISSR引物委托上海生工生物科技有限公司合成。所述ISSR引物的核苷酸序列为：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGG-3’。2.双孢蘑菇DNA提取与电泳双孢蘑菇DNA提取与检测按照文献[陈美元,廖剑华,王波,李洪荣,卢政辉,郭仲杰,蔡丹凤,王泽生.中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J].食用菌学报,2009,(01):11-16.]。3.ISSR-PCR反应体系与条件ISSR-PCR反应体系与条件参照文献[陈美元,廖剑华,李洪荣,郭仲杰,卢政辉,蔡丹凤,王泽生.双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J].中国农学通报,2009,(04):149-156.]。反应体系为：模板DNA30ng，引物30ng，dNTPs0.1mmol/L，MgCl22.5mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，1×PCR缓冲液，用ddH2O补总体积至20μL。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，扩增40个循环；72℃延伸7min，4℃保存。4.结果分析ISSR-PCR检测结果如图1和图2，1-24号为双孢蘑菇G型菌株，24个菌株均扩增出约300bp的特异条带，检出阳性率为100%。25-48号为双孢蘑菇非G型其它菌株，24个菌株均未扩增出300bp特异性条带，检出阳性率为0%。因此，该标记与双孢蘑菇G型菌株性状紧密连锁，应用该标记可以非常方便地在菌丝阶段对双孢蘑菇不同类型菌株进行区分和鉴定。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，凡依本专利技术申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本专利技术的涵盖范围。SEQUENCELISTING<110>福建省农业科学院食用菌研究所<120>一个用于鉴别双孢蘑菇菌株类型的ISSR标记及应用<130>1<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>1agagagagagagagagg17本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个用于鉴别双孢蘑菇菌株类型的ISSR标记引物，其特征在于：所述ISSR标记引物核苷酸序列为：5’‑AGAGAGAGAGAGAGAGG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一个用于鉴别双孢蘑菇菌株类型的ISSR标记引物，其特征在于：所述ISSR标记引物核苷酸序列为：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGG-3’。2.利用权利要求1所述ISSR标记引物的检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈美元，廖剑华，蔡志欣，李洪荣，郭仲杰，卢政辉，王泽生，
申请(专利权)人：福建省农业科学院食用菌研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35