一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用制造技术

本发明专利技术提供了一个用于鉴定双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及其应用，双孢蘑菇菌株根据农艺性状不同可分为G型、H型、HG型等不同类型，利用RAPD分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增，仅G型菌株能扩增出2500bp特异片段。本发明专利技术的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇G型菌株,而不用经过出菇试验。该方法耗时短，操作简便，特异性强，可以在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定亲本菌株的特性，极大地提高了双孢蘑菇杂交育种的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体涉及一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用。
技术介绍
我国是世界上最大的双孢蘑菇科研、生产、加工与出口的国家，2015年全国产双孢蘑菇鲜品达230多万吨，占世界年产量的一半以上，产值100多亿元人民币，因此双孢蘑菇生产具有显著的经济效益、社会效益和生态效益。福建省农业科学院食用菌研究所（本专利技术人单位）30年来收集世界各地的双孢蘑菇种质资源达450多株，保藏量占世界第三位，仅次于美国和法国。根据菌株的栽培农艺特性，结合酯酶同工酶表型分析，可把这些菌株区分为G型、H型、HG型等不同类型，其详细的农艺特征见下表。在杂交育种中需要选择不同类型的亲本，传统的筛选手段盲目性强，需要进行出菇来筛选，工作量巨大。RAPD (随机扩增的多态性DNA)技术在生物学许多研究领域已得到广泛的应用，它克服了同工酶和RFLP等技术的一些缺点，快速、简便、灵敏度高、需样量少。本专利技术人通过大量的引物筛选和验证，找到了一个适用于双孢蘑菇菌株类型预测的、操作快速简便的分子标记。利用该分子标记能在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定用作亲本的G型菌株，不用出菇试验，省时省力，这对杂交育种中缩短育种周期、提高育种效率有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术基于分子标记技术，建立一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用。本专利技术为一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用，是利用RAPD分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增。利用RAPD引物对双孢蘑菇菌株基因组DNA进行RAPD-PCR，能特异性地扩增出2500bp的产物，所述RAPD引物的核苷酸序列为：5’-ACAACGCCTC-3’。所述的RAPD-PCR方法按照本专利技术人文献 [陈美元,廖剑华,李洪荣,郭仲杰,卢政辉,蔡丹凤,王泽生. 双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 中国农学通报,2009,(04):149-156.]，具体条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸1min，扩增42个循环；72℃延伸5min, 4℃保存。反应体系为：30 ng模板DNA，30 ng引物，0.1 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2，1 U Taq DNA聚合酶，1×PCR缓冲液，用ddH2O将总体积补至20µL。所述引物与标记条带在鉴别双孢蘑菇G型菌株上的应用。本专利技术的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇G型菌株，该方法耗时短，操作简便，特异性强，无需出菇，省时省力。根据特异性扩增产物2500bp条带的有无来鉴定菌株类型，具有该条带的菌株为G型菌株，没有该条带的菌株为非G型菌株。附图说明图1 双孢蘑菇24个G型菌株的RAPD图谱，M: LambdaDNA/EcoRI+HindIII Markers；1-24：沪8213，8211，闽1号，As376，As1671，As1789，As321，As555，T-8205，A，D，沪101，21，22，175，751，福罐3，福罐10，厦前751，仙游841，沪102-1，黄岩62，浣沙176-4，Ag10。右边箭头指示特异条带位置，显示24个G型菌株均扩增出2500bp特异条带。图2 双孢蘑菇24个非G型菌株的RAPD图谱，M: LambdaDNA/EcoRI+HindIII Markers；25-48：102-2，苏锡一号，T-03，111-455，111，浣沙176，浣沙176-3，245-6，F4，F20，Ag6，8132D，02，7001，7601，701，Ag18，台-1，0072，S46，50-1，125，浣沙176-2，日本118。右边箭头指示特异条带位置，显示24个非G型菌株均未扩增出2500bp特异条带。具体实施方式实施例11.Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2 、dNTPs购自厦门泰京生物有限公司，RAPD引物购自上海生工生物科技有限公司。所述RAPD引物的核苷酸序列为：5’-ACAACGCCTC-3’。2.双孢蘑菇DNA提取与电泳双孢蘑菇DNA提取与DNA电泳按照文献[陈美元,廖剑华,王泽生. 双孢蘑菇三种类型菌株的RAPD扩增研究. 食用菌学报,1998,5(4):6-10.]。3.RAPD-PCR反应体系与条件RAPD-PCR反应体系与条件按照文献 [陈美元,廖剑华,李洪荣,郭仲杰,卢政辉,蔡丹凤,王泽生. 双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 中国农学通报,2009,(04):149-156.]，反应体系为：30 ng模板DNA，30 ng引物，0.1 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2，1 U Taq DNA聚合酶，1×PCR缓冲液，用ddH2O将总体积补至20µL。扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸1min，扩增42个循环；72℃延伸5min, 4℃保存。扩增产物20 µL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，GeneFinder荧光染料染色并拍照。4.结果分析RAPD-PCR检测结果如图1、图2，1-24号为双孢蘑菇G型菌株，扩增出约2500bp特异性DNA条带，检出阳性率为100%。25-48号为双孢蘑菇非G型菌株，均未扩增出2500bp特异性条带，检出阳性率为0%。因此，该标记与双孢蘑菇G型菌株性状紧密连锁。该标记与方法可以非常方便地对双孢蘑菇G型或非G型菌株进行区分和鉴定。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，凡依本专利技术申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本专利技术的涵盖范围。 SEQUENCE LISTING<110> 福建省农业科学院食用菌研究所<120> 一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记及应用<130> 1<160> 1<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 10<212> DNA<213> 人工序列<400> 1acaacgcctc 10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记引物，其特征在于：所述RAPD标记引物的核苷酸序列为：5’‑ACAACGCCTC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一个用于区分双孢蘑菇菌株类型的RAPD标记引物，其特征在于：所述RAPD标记引物的核苷酸序列为：5’-ACAACGCCTC-3’。2.利用权利要求1所述的引物区分双孢蘑菇菌株类型的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈美元，廖剑华，郭仲杰，李洪荣，蔡志欣，卢政辉，王泽生，
申请(专利权)人：福建省农业科学院食用菌研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35