一种黄瓜花叶病毒RT‑LAMP检测试剂盒及检测方法，所述检测方法包括以下步骤：S1使用由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris‑HClpH7.5构成的快速提取液，从待测样品中提取总RNA，并作为RNA模板；S2使用设计的上游引物、下游引物及环引物，构建RT‑LAMP反应体系；S3将所述RT‑LAMP反应体系，置于65℃水域中，反应60分钟，得到反应液；S4对所述反应液进行检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种黄瓜花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法，具体涉及雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)RT-LAMP引物组的建立，CMV RT-LAMP检测试剂盒的应用。
技术介绍
黄瓜花叶病毒(CMV)是雀麦花叶病毒科黄瓜花叶病毒属代表种，为三分体基因组和一个亚基因组，均为正单链RNA病毒，RNA1长3357bp，RNA2长3050bp，RNA3长2216bp，RNA4为RNA3的亚基因组，长1000bp。CMV是一种非常严重的病毒病害，病毒可达到除生长点以外的任何部位。该病毒寄主范围多、分布广，具经济重要性的植物病毒之一，能侵染1000多种双子叶和单子叶植物。CMV可由60多种蚜虫以非持久方式传播，易机械接种传播，是我国十字花科、茄科、豆科及葫芦科蔬菜上最主要的病院病毒，也是烟草、香蕉、西番莲的重要病原，我国已从38个科的120多种植物上分离到CMV。环介导的等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根据目的基因的6个特异区域，设计4-6条特异性引物，利用Bst DNA聚合酶在60～65℃等温条件下特异地扩增目的基因。LAMP扩增反应可在60分钟之内完成，其扩增产物是和靶标反向重复的茎环结构以及多环的菜花样结构，反应过程中产生大量焦磷酸根离子，并形成焦磷酸镁白色沉淀。LAMP方法可以通过多种方法判断结果，如反应后体系内是否存在白色沉淀物、电泳结果是否具有梯状条带、加入SYBR Green I是否变成绿色等，具有检测灵敏度高，检测方法简单快速、仪器要求不高等特点。然而就引物设计方面，目前报道的文献多是以在线方式(Primer Explore)设计引物，应用范围受到限制，根据LAMP原理自行设计多组引物组，通过实验结果选取最适引物组，构建LAMP检测方法，这样将会大大增加LAMP的适用范围，具有更为广泛的应用前景。自LAMP技术建立以来，该技术已经广泛应用于对病菌、寄生虫等的检测，近年来在动物病毒的检测研究中逐渐推广起来，然而对于植物病毒如黄瓜花叶病毒还没有相应的检测试剂盒的报道，因此开发一种针对黄瓜花叶病毒的RT-LAMP试剂盒具有重要的应用价值。
技术实现思路
CMV检测主要有DTBIA、ELSA、RT-PCR、RT-nested PCR、real-time RT-PCR等方法。DTBIA灵敏度较低；而RT-PCR、RT-nested PCR和real-time RT-PCR核酸检测技术需要昂贵的专业仪器，且核酸扩增的时间较长。本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速黄瓜花叶病毒RT-LAMP检测方法。本专利技术人在坚持不懈的努力之下，专利技术了一种快速提取RNA待测样品的方法，并结合自己设计的引物，使用RT-LAMP检测方法，能够快速有效地检测出黄瓜花叶病毒。本专利技术提供(1)一种黄瓜花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述RT-LAMP引物为：(2)如(1)所述的试剂盒，还包括黄瓜花叶病毒的RNA的快速提取液，所述快速提取液由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成。(3)如(2)所述的试剂盒，其中，所述二甲基甲硫胺的体积浓度为6％。本专利技术还提供如下检测黄瓜花叶病毒的方法，(4)一种黄瓜花叶病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤S1使用由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成的快速提取液，从待测样品中提取总RNA，并作为RNA模板；S2使用如(1)所述试剂盒，构建RT-LAMP反应体系，所述反应体系为20μL，包括：2×反应缓冲液(RM)10μL，酶溶液(EM)0.8μL，40pmol/μL上游引物FIP 0.8μL，40pmol/μL上游引物BIP0.8μL，10pmol/μL下游引物F3 0.4μL，10pmol/μL下游引物B3 0.4μL，浓度均为20pmol/μL的环引物LB0.8μL，RNA模板1.6μL，及去离子水(DW)4.4μL；S3将所述RT-LAMP反应体系，置于65℃水域中，反应60分钟，得到反应液；S4对所述反应液进行检测。(5)如(4)所述的RT-LAMP检测方法，其中，所述二甲基甲硫胺的体积浓度为6％。(6)如(4)所述的RT-LAMP检测方法，其中所述S4步骤中是在所述反应液中加入加入钙黄绿素荧光染料，通过反应管内所产生的颜色变化判断检测结果。本专利技术根据CMV的基因序列设计RT-LAMP引物，通过实验最终建立了CMV的RT-LAMP检测方法，为CMV的检测提供了一种快速高效、特异灵敏的新方法，灵敏度高，比普通RT-PCR灵敏度高10倍；并可通过肉眼观察浊度或颜色反应直接进行结果判断。该方法适用于现场CMV的快速检测。本研究的目的就是研制该病毒的快速高效、灵敏特异的检测技术，与以往研究的方法形成一个不同层次的检测体系，使检测人员根据不同条件和目的可以进行广泛有效的选择，为黄瓜种苗检验检疫及生产田的病害监测提供有效的技术支持。附图说明图1最佳反应温度扩增曲线。图2特异性实验中扩增曲线结果。图3特异性试验中颜色反应结果。具体实施方式为解决上述技术问题，设计1套用于检测CMV的引物组，包括正向外引物F3-1的序列为SEQ ID NO.1，反向外引物B3-1的序列为SEQ ID NO.2；正向内引物FIP-1的序列为SEQ ID NO.3，反向内引物BIP-1的序列为SEQ ID NO.4；以及环引物LB，具体序列见表1。表1引物序列Loopamp RNA扩增反应试剂盒、Loopamp反应管、Loopamp FD荧光检测试剂购自日本荣研化学株式会社，RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，其他试剂均为常规分析纯试剂。采用日本荣研化学株式会社生产的LA-320C实时浊度仪。试验例1核酸提取分别称取感染CMV病毒或未感染的(对照用)的黄瓜叶片0.1g，或者用镊子获取相当于0.1g大小的黄瓜叶片作为实验用材料。RNA提取方法1：使用RNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取样品总RNA，具体操作按试剂盒说明进行。本试验具体使用了QIAGEN Rneasy Mini kit提取RNA，也可以采取其它试剂盒进行提取，或者通常实验室提取方法提取RNA。RNA提取方法2：采用本专利技术的试剂盒，更加快速简便地提取RNA粗提液。具体是用镊子取黄瓜新生叶片约0.1g，迅速置于研砵中，研砵中预先加入含有10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成的提取液5mL，并迅速研磨3min，然后静置2min，取1.6μL作为RNA模板。所述镊子、研砵、研磨棒及其它试验用具需要在DEPC水中浸泡12小时后，150度烘烤6小时，然后取出放置于4℃冷藏备用。含有10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺的1M Tris-HClpH7.5溶液为事先配好，高温高压消毒处理后，放置于4℃冷藏备用。移液抢的枪头以及各种反应管均使用RNA酶free产品。所述10％的乙酸乙酯的浓度是指100ml溶液中，含有1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄瓜花叶病毒RT‑LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括RT‑LAMP引物，所述RT‑LAMP引物为：上游外引物FIP序列SEQ ID NO.3；上游内引物BIP序列SEQ ID NO.4；下游外引物F3序列SEQ ID NO.1；下游外引物B3序列SEQ ID NO.2；以及环引物LB序列SEQ ID NO.5。
【技术特征摘要】
1.一种黄瓜花叶病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述RT-LAMP引物为：上游外引物FIP序列SEQ ID NO.3；上游内引物BIP序列SEQ ID NO.4；下游外引物F3序列SEQ ID NO.1；下游外引物B3序列SEQ ID NO.2；以及环引物LB序列SEQ ID NO.5。2.如权利要求1所述的试剂盒，还包括黄瓜花叶病毒的RNA的快速提取液，所述快速提取液由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成。3.如权利要求2所述的试剂盒，其中，所述二甲基甲硫胺的浓度为6％。4.一种黄瓜花叶病毒RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤S1使用由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5构成的快速提取液，从待测样品中提取总RNA，并...
【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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