本发明专利技术涉及植物分子标记引物设计方法，具体为基于普通小麦抗病序列的全基因组SSR特异分子标记开发方法，解决目前现有的小麦抗病育种SSR标记存在点位多、与目的基因距离较远的问题，操作步骤为：1）、下载全基因组数据，建立本地数据库；2）、用抗病类基因家族的隐马尔可夫模型检测数据库，所得序列经筛选得包含目标抗病结构的蛋白序列，再检索本地数据库，得到相应的基因组序列片段scaffold；3）、检测每条scaffold序列中的简单重复序列位点，在SSR位点两侧设计引物，合成；4）、特异标记筛选；5）、标记多态性检测。SSR特异分子标记的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.78所示的序列。优点：1、位置明确、特异性强；2、与抗病候选基因距离极其紧密。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及植物分子标记引物设计方法，尤其设及小麦分子标记引物设计方法， 具体为普通小麦抗病序列的全基因组SSR特异分子标记及开发方法。
技术介绍
小麦作为我国传统的主粮作物，其生产关乎国家粮食安全和人民生活水平，然而 由病原菌入侵引起的白粉病、诱病等小麦病害在我国各大麦区均常年发生，导致小麦严重 减产。W白粉病为例，1990年和1991年全国白粉病大爆发造成当年1.44亿吨和0.77亿 吨小麦产量的损失。小麦抗病分子育种可大大缩短育种年限，使育成种能尽快用于生产 减少损失，是防治小麦病害最经济、安全和有效的方法。育种过程中用于抗病基因定位和 辅助选择的分子标记主要是SSR(SimpleSequenceRepeats)标记，该类标记为第二代 分子标记，变异丰富而且成本低廉。在小麦测序草图未公布之前，有专利技术（申请号 201310579379. 1)利用现有SSR标记引物比对小麦片段重叠群来扩充标记数量，从而加密 遗传图谱。但由于小麦具有庞大的基因组(为水稻的40倍，玉米的6. 6倍)和高度重复的序 列（80%W上)，使得利用序列片段开发的SSR标记常存在多位点现象，加之用于分子标记辅 助选择（MAS,MarkerAssistedSelection)的SSR标记与目标基因遗传距离大都在IcMW 上，极容易造成MAS过程中标记所跟踪信息的丢失，导致育种失败。该专利方法虽然增加了 SSR标记的多态性，但由于其自身方法存在的局限性，仍无法解决SSR标记本身存在的位点 多W及与目的基因距离远的问题。而目前虽然研发出了高精准度的商业化SNP标记忍片， 却因成本较高，不能大规模用于实际生产。 植物中的抗病基因能通过编码不同的保守蛋白结构来抵御病原菌入侵，如蛋白激 酶（proteinkinase,PK)、跨膜结构域（transmembranedomain,TM)和核巧酸结合位点 (nucleotidebindingsite,NBS)等，其中NBS类基因是植物中数量最多的一类抗病基 因。在目前已克隆的13个小麦抗病基因中，/?泌、你光、巧??·?/、/?必·、化Zr7、化 义5>甘5运10个基因均为NBS类抗病基因，其余3个为ΡΚ类（/?。厶ZrJ仿和TM类（/?泌） 抗病基因。随着2014年小麦测序草图的公布，使得在全基因组范围内分离小麦抗病序列成 为可能。基于小麦抗病序列开发的SSR标记，不但保留了丰富多态性，而且具有极高的特异 性W及与抗性的连锁程度，并且成本低廉，可广泛用于小麦抗性基因定位、候选基因筛选、 遗传图谱构建W及分子标记辅助育种等。
技术实现思路
本专利技术解决目前现有的小麦抗病育种SSR标记存在点位多、与目的基因距离较远 的问题，提供一种普通小麦抗病序列的全基因组SSR特异分子标记及开发方法。 阳0化]本专利技术是采用如下技术方案实现的：普通小麦抗病序列的全基因组SSR特异分子 标记开发方法，包括W下操作步骤： 1) 、本地数据库构建：下载普通小麦品种蛋白数据和全基因组数据，建立本地数据库； 2) 、目的序列获得及检测：利用已克隆抗病类家族基因得到的隐马尔可夫模型文件检 索小麦蛋白数据，所得序列经结构域检测筛选出包含目标抗病结构的完整编码蛋白序列， 根据小麦蛋白序列的染色体分布图选出位于某一染色体上的序列，将运些序列检索本地全 基因组数据库得到相应的基因组序列片段（即scafTold); 3) 、SSR位点确定及标记开发：检测每条scafTold序列上的简单重复序列位点，在SSR 位点两侧设计引物，合成核巧酸序列，得到相应的SSR分子标记。 第一步利用小麦蛋白数据和全基因组数据建立本地数据库，便于后续进行数据检 索。第二步利用现有技术中可下载得到的已克隆抗病类基因家族的模型文件检索本地蛋白 数据库，获得包含完整目标结构的蛋白序列；为方便下一步染色体特异标记的开发，W单条 染色体臂为单位，将每条臂上所有目标蛋白序列检索基因数据库，得到对应的基因组序列 片段，完成目标蛋白序列向基因序列的转化。第Ξ步将得到的基因序列检索得到SSR位点， 在位点两侧设计引物，送至公司合成相应的核巧酸序列，即得到本专利技术方法开发的SSR分 子标记。 本专利技术还可W包括W下操作步骤：4)、特异标记筛选缺体-四体和双端体材料 的基因组DNA作为模板，所合成SSR标记为引物进行PCR反应，所述PCR反应的产物经8% 非变性聚丙締酷胺凝胶电泳后用银染法染色，于灯箱上观察并拍照记录。拍照结果显示，标 记在某个缺体-四体中扩增不出目标带，表明该标记位于此缺体-四体所缺失的染色体上， 标记在双端体中扩增不出目标带，表明该标记不在此双端体染色体臂上，而是位于其对应 的另外一半染色体臂上。[000引本专利技术在保留了现有SSR标记技术变异类型丰富和成本低廉的基础上，还具有W下有益效果：1、位置明确、特异性强；本方法中开发的每个分子标记均具有明确的基因组 位置，并且经过中国春缺体-四体和双端体材料筛选，标记具有极高的特异性，大大减少了 基因定位过程中小麦A、B、D亚基因组之间的误差；2、与抗病候选基因距离极其紧密；本方 法中开发的每个分子标记均与小麦抗病序列位于同一条scafTold序列上，当某个抗病序 列被确定为抗病基因时，其最近的SSR标记与之紧密连锁，几乎不发生交换，可W作为共分 离标记使用，极大的提高了育种过程中分子标记辅助选择的效率。【附图说明】 图1为小麦2AL染色体上NBS-SSR标记开发流程图； 图2为小麦TaNBS蛋白序列的染色体分布； 图3为小麦NBS-SSR标记的特异性筛选图； 图4为小麦NBS-SSR特异标记多态性检测图。【具体实施方式】 为了使本专利技术的技术方案更加清楚明白，接下来W普通小麦品种中国春2A染色 体长臂上NBS-SSR标记开发为例，结合附图对本专利技术进行进一步详细说明。 基于小麦NBS抗病序列的全基因组SSR特异分子标记开发方法： 1)、本地数据库构建：从URGI数据库 〇ittps://urgi·Versailles,inra.fr/)中 下载普通小麦品种中国春蛋白数据（Ta.IWGSC2.25.p巧.all.fa)和全基因组数据（Ta.IWGSC2. 25.化a.c虹ο. 2AL.fa),利用NCBI本地BLAST工具建立本地全基因组数据库，所用 命令为i^ormatdb-iTa.IWGSC2. 25.化a.C虹0. 2AL.fa-pF-〇t; 2)、目的序列获得及检测J:从Pfam数据库化ttp://pfam. sanger. ac.址/)中下载 NBS家族(登录号为PF00931)的隐马尔可夫模型文件NB-ACR.hmm，在Hmmer3.0软件中 通过hmmsearch程序检索小麦蛋白数据包，获得3982条蛋白序列，之后用SMART服务器 化t1:p://sma;rt. embl-heide化erg. de/)进行结构域检测，E值设为0,从中筛选出2406条 包含NBS结构的完整蛋白序列，根据序列编号选出位于2AL染色体上的56条NBS序列巧曰 图2所示，2AL染色体上包含56条NBS序列)，将运些序列检索本地全基因组数据库得到相 应的基因组序列片段（scaffold),检索命令为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于普通小麦抗病序列的全基因组SSR特异分子标记开发方法，其特征为包括以下操作步骤：1）、本地数据库构建：下载普通小麦品种蛋白数据和全基因数据，建立本地数据库；2）、目的序列获得及检测：利用已克隆抗病类家族基因得到的隐马尔可夫模型文件检索小麦蛋白数据，所得序列经结构域检测筛选出包含目标抗病结构的完整编码蛋白序列，根据小麦蛋白序列的染色体分布图选出位于某一染色体上的序列，将这些序列检索本地全基因组数据库得到相应的基因组序列片段scaffold；3）、SSR位点确定及标记开发：检测每条scaffold序列上的简单重复序列位点，在SSR位点两侧设计引物，合成核苷酸序列，得到相应的SSR分子标记。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乔麟轶，畅志坚，张晓军，常建忠，郑军，李欣，詹海仙，郭慧娟，高建刚，张文萍，
申请(专利权)人：山西省农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：山西;14
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