单花粉全基因组扩增库的快速制备方法技术

植物单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，具体涉及植物单花粉的分离、快速裂解和全基因组复制扩增。本发明专利技术的技术方案是：在载玻片上将花粉染色、干燥，制备花粉粒玻片；应用一种显微解剖镊子在显微镜下分离单个花粉，放入ＰＣＲ管中，在碱和表面活性剂溶液中裂解后用ＴＥ缓冲溶液中和。裂解混合液直接作为模板在试剂盒Ｇｅｎｏｍｉｐｈｉ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ方法中工作，将单个花粉的ＤＮＡ复制扩增出大量全基因组，该方法能应用于大批量单花粉收集并制备全基因组，为植物单倍体遗传规律分析和通过单倍体染色体制图提供了一种新的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单花粉全基因组扩增库的制备方法，尤其涉及单花粉全基 因组扩增库的快速制备方法、试剂配方及技术，实现单个植物性细胞遗传物质的多次 分析。
技术介绍
花粉是植物的性细胞，其遗传分离规律直接决定了杂种一代的性状表 现。单花粉PCR检测技术已经在几个物种上成功，但由于单个花粉分离和裂解的困难， 以及单花粉只含痕量遗传物质，PCR检测只能做一次，不能重复检测，限制了现有分子生物学技术在单花粉遗传分析in染色体制图上的应用。而要对花粉进行分子遗传分析，如分子标记，则需要对同一个单花粉进行不同引物、多次PCR反应，由于单个花 粉只含有痕量的DNA，进行一次PCR反应尚且困难，更不用说进行多次PCR检测。现 有研究尚停留在如何进行单个花粉PCR反应。如能将单个花粉粒分离、裂解并进行全 基因组复制扩增，将单个花粉的DNA放大到上百万倍，则问题就会迎刃而解。全基因 组扩增技术(Whole Genome Amplification, WGA)是近年来发展起来的新型DNA复 制技术，它提供了一种从微量基因组DNA获取大量遗传信息的途径，在人类遗传分析 方面应用较多(Blanco et al. 1989; Zhang et al. 1992; Esteban et al. 1993)， 尤其为法医处理微量检材提供了一个有用的工具，有关技术方面的详细信息可访问西 格玛 (SIGMA ) 公司全基因组扩增技术专业网站 http://www. sigmaaldrich. com/Life—Science/Molecular—Biology/PCR/Product—Li nes/Whole—Genome_Amplification.html。利用全基因组扩增技术(WGA)制备单花粉 全基因组扩增库以实现对植物生殖细胞的遗传分析，国内外尚没有同类研究报道。通过花粉粒群体研究亲本的遗传规律，关键在于建立单花粉PCR方法和实现单花 粉的多次分子检测。由于花粉粒作为单倍体细胞本身只含有微量的DNA，比常规PCR 方法利用的模板含量低得多，所以单花粉PCR是一个限制因子；花粉粒非常小，又相 互粘连，使得分离单花粉粒成为另一个限制因子。另外，自然条件下花粉粒在花粉囊 裂解后只能存活几分钟(Fritz and Lukaszewski 1989; Khatun and Flowers 1995; Luna et al. 2001)。因此基于花粉活性的研究，取样和遗传分析的效率显得很重要。 目前，应用于花粉粒的PCR检测技术还主要停留在PCR技术的验证性研究方面，少数 几种植物的单花粉PCR检测技术基本建立(Aziz and Sauve 2003; Li a丄1990; Matsunaga s丄1999; Parducci et a丄2005; Petersen " s丄1996; Zhang s丄1992)，但一粒花粉只能检测一次，不能重复使用；花粉数量小，最多的一例只有60粒(Aziz^a丄2005)。可见，当前有关单个花粉分子检测技术还无法实现对单个 花粉进行分子遗传分析。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方 法，单花粉分离裂解后，即可直接进行WGA扩增，利用Phi29DNA聚合酶(Phi29DNA polymerase)的高保真全基因组DNA复制活性扩增产生大量的全基因组DNA，为植物 单倍体细胞遗传分析提供大量DNA模板。该方法能应用于大批量单花粉收集并制备足 量全基因组DNA，为分析植物单倍体性细胞遗传规律和通过单倍体染色体制图创造首 要条件。本专利技术的一种，其特征在于由以下步骤组成1、 滴1-2滴染色液在载玻片上备用；将供试作物的花药浸入染色液中，在显微 镜下用镊子分离，取单个完整、干净、未开裂的花药，然后用镊子挑破花粉囊壁，释 放出花粉粒；染色后，将染色液排净，用30mM灭菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花 粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整个操作过程在无菌环境中进行；所述染色液组成成分 为0.7 raM苯胺磷酸氢二铵蓝和30 mM蔗糖的水溶液；所述花粉粒的直径》0. Olmm; 所述镊子为显微解剖镊子DUMONT No. 11254-20。2、 分装0.5W裂解液于96孔PCR板的PCR管中，密封并离心，使裂解液沉于管 底；应用镊子直接在显微镜下分离着色的单个花粉粒，放入96孔PCR板的PCR管底 的裂解液中。所述裂解液的组成成分为终浓度0. 1M的NaOH与2%的Tween-20的水溶 液的混合液。裂解液的制备方法为各吸取欲配制终体积十分之一的1.0 M NaOH储 备水溶液和终体积十分之一的20% Tween-20储备水溶液混合，加入终体积十分之八 的灭菌双蒸水混匀即为裂解液。3、 分装5W矿物油于含裂解液和单个花粉粒的96孔PCR板的PCR管中，密封并 短暂离心；所述的短暂离心以8000转/分离心，时间一般不超过10秒。4、 在PCR仪上裂解后用与裂解液等体积的TE缓冲溶液中和，成为裂解混合液； 所述TE缓冲溶液的组成成分为0. 1 M Tris-HCl和2 mM EDTA的水溶液的混合液。5、 每管中的裂解混合液分别全部作为一次反应的模板直接进行全基因组扩增， 获得单花粉全基因组扩增库。具体按照试剂盒Genomiphi DNA Amplification Kit(Amersham Biosciences Corp. 928 East Arques Avenue, Sunnyvale CA 94085 USA) 的说明书中提供的方法进行全基因组扩增①向每管含单花粉的裂解混合液中加入 Sample buffer 9 41， 95°C保温3 min，迅速放置冰上(0°C);②加入mix reactionbuffer 9 W;③加入Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNA polymerase) 1W(冰上操作)，30°C保温18 hrs: 65'C保温10 min灭活，低温保存，即得到单花粉全基因组扩增产物，所得DNA量可供上百甚至更多次分析之用。染色液(0.7 mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30 raM蔗糖的水溶液)中的苯胺磷酸氢二铵蓝主要是为了活细胞染色，30 mM蔗糖的水溶液主要是保持花粉粒渗透压，避免破裂；原料纯度要求分析纯或以上；裂解液主要是为了溶解细胞，释放基因组DNA;原料纯度要求分析纯或以上； 矿物油主要是为了减少裂解液蒸发，保持裂解液体积和各成分浓度；原料纯度要求分析纯或以上；TE缓沖溶液是为了中和裂解液，保持ra值原料纯度要求分析纯或以上； 试剂盒中各成分主要是为了全基因组复制扩增。本专利技术的有益效果是，可以快速分离和裂解单个花粉，释放出基因组DNA，直接 作为模板利用全基因组扩增试剂盒将单个花粉的DNA复制扩增出大量全基因组，经稀 释后可直接作为PCR分析的模板，没有常规丽A提取纯化方法的烦琐过程，该方法操 作简单、方便、快速，不影响检测灵敏度和准确性。本专利技术具有的优点为1) 效率高到目前为止，由于显微操纵器本身烦琐的操作过程限制，单个试验 受试的花粉粒个数最多没有超过60，分离单花粉粒效率很低；而应用本专利技术的方法， 一个经过培训的人每天可以进行288个即3个96孔P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：　（１）滴１－２滴染色液在载玻片上备用；将供试作物的花药浸入染色液中，在显微镜下用镊子分离，取单个完整、干净、未开裂的花药，然后用镊子挑破花粉囊壁，释放出花粉粒；染色后，将染色液排净，用３０ｍＭ灭菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整个操作过程在无菌环境中进行；所述染色液组成成分为０．７ｍＭ苯胺磷酸氢二铵蓝和３０ｍＭ蔗糖的水溶液；　（２）分装０．５μｌ裂解液于９６孔ＰＣＲ板的ＰＣＲ管中，密封并离心，使裂解液沉于管底；应用镊子直接在显微镜下分离着色的单个花粉粒，放入９６孔ＰＣＲ板的ＰＣＲ管底的裂解液中；　（３）分装５μｌ矿物油于含裂解液和单个花粉粒的９６孔ＰＣＲ板的ＰＣＲ管中，密封并短暂离心；所述裂解液的组成成分为终浓度０．１Ｍ的ＮａＯＨ与２％的Ｔｗｅｅｎ－２０水溶液的混合液；　（４）在ＰＣＲ仪上裂解后用与裂解液等体积的ＴＥ缓冲溶液中和，成为裂解混合液；　（５）每管中的裂解混合液分别全部作为一次反应的模板直接进行全基因组扩增。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈平华，高三基，陈由强，许莉萍，陈如凯，徐景升，郭晋隆，张华，王恒波，蔡澜峰，潘永保，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]