一个小麦ＰＤＲ型的ＡＢＣ转运蛋白基因及其所编码的蛋白质制造技术

本发明专利技术公开了一个来自于小麦品种望水白的ＰＤＲ型的ＡＢＣ转运蛋白基因及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域。ＰＤＲ转运蛋白基因（ＴａＰＤＲ１）的ｃＤＮＡ序列为ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１及其编码的氨基酸序列为小麦ＰＤＲ型的ＡＢＣ转运蛋白基因及其所编码的蛋白质。该基因在小麦中首次报道，ｍＲＮＡ表达分析表明该基因受ＤＯＮ诱导增强表达；染色体定位信息显示该基因定位在小麦的５Ａ染色体上；转基因实验证明该基因在拟南芥体内超量表达可以提高野生型拟南芥哥伦比亚生态型（Ｃｏｌ０）对毒素ＤＯＮ的抗性。该ＰＤＲ型的ＡＢＣ转运蛋白基因可作为目的基因导入感赤霉病小麦品种，可以降低小麦籽粒中ＤＯＮ的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一个来自小麦(rr"ic鹏aseOV， L.)品种望水白的PDR (Pleiotropic Drug Resistance)型的ABC (ATP-Binding Cassette)转运蛋白基 因及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域，该PDR型的ABC转运蛋白基因可作为 目的基因导入感赤霉病小麦品种，可以降低小麦籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (deoxynivalenol， DON)的含量。二、
技术介绍
-由赤霉菌(^ksarj'"/B gr3肌'/7era咖)侵染引起的赤霉病(raB)是一种世界范围的真菌性病害，可对小麦，大麦、玉米等作物产生危害。该病害不仅直接造成作物 减产，因赤霉菌在籽粒中可产生对人和动物都非常有害的DON和其他一些 trichothecene toxins,故粮食品质也受到严重影响。在赤霉菌产生的毒素中，DON 是其中重要的一种，也称为致呕毒素，该毒素属于单端孢霉烯(trichothecenes) 家族，是包括中国在内的许多国家的粮食中最普遍存在的一类毒素，对人和动物的 副作用主要是影响神经系统，降低免疫力。为了保护消费者的安全，目前，很多国 家都对小麦面粉中DON的含量做出了一定的限制。人们最早将小麦对赤霉病的抗性分为抗侵染(Type I)和抗扩展(Type II) 两种类型。后来的研究发现抗病品种存在能够阻止毒素DON合成或促使其降解的因 素，于是又提出了第三类抗性(Type III)即抗毒素或降解毒素积累。自第三类抗 性(Type III)提出后，人们在这方面做了很多的工作，已经发现了一些和抗毒素 或降解毒素积累相关的基因，从抗病品种中分离出来的具有降解DON功能的镰刀菌 乙酰基转移酶基因；还从拟南芥中克隆出了可以降低D0N毒性的UDP-葡萄糖基转移 酶基因；PDR转运蛋白首先是在酵母(&Jcc/ aro历yces cerew'sj'ae)中发现，与抗真 菌性药物的代谢有关，是作为排出胞内有毒化合物的泵，可以将真菌产生的细胞毒 素排出体外，减少对细胞的毒害。酵母,/W堪因的突变体对赤霉菌产生的细胞毒素 DON比野生型更为敏感，显示了PDR蛋白在抗DON中的作用。但是在小麦中还没有发 现有这类基因的报道。小麦品种望水白是到目前为止大家公认的抗赤霉病最好，抗 性最稳定、DON含量也很低的一个品种，所以从望水白中克隆出转运DON的基因、将 之转到其他感病小麦品种中，有望降低小麦籽粒中DON的含量。三
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于公开一个来自小麦(7^'Wc"历L.)品种望水白的 PDR型的ABC转运蛋白基因及其所编码的蛋白质，可作为目的基因导入其它小麦品 种，提高小麦的赤霉病抗性，降低小麦籽粒中的DON的含量，进行小麦品种改良。 技术方案本专利技术的PDR型ABC转运蛋白基因，来自小麦品种望水白，命名为7a尸ZW7基 因，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。该PDR型的ABC转运蛋白基因及其所编码的蛋 白质，命名为TaPDRl蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。 有益效果1、 本专利技术公开了一个PDR型的ABC转运蛋白基因(&尸ZW7)及其所编码的蛋白质。 PDR型的ABC转运蛋白基因为小麦中的首次报道，该基因来自小麦品种望水白，可 作为目的基因导入其它感赤霉病小麦品种，提高小麦的赤霉病抗性，降低小麦籽粒 中的DON的含量，进行小麦品种改良。2、 拟南芥转基因阳性植株的T2代种子和非转基因种子，置于含浓度为20ng/ml DON的1/2MS培养基上，30天后，转基因植株叶片比较大，伸展度好，子叶保持 绿色，长出长长的白色的根；而对照则叶片比较小，叶片萎縮畸形，子叶已经枯黄， 而且幼苗的真叶数目较少，没有长出根(如图5)。表明TaPDRl与细胞毒素DON 的抗性有关，植物中的PDR转运蛋白定位在细胞膜上，负责物质的跨膜运输，所 以我们推测TaPDRl可以将赤霉菌产生的细胞毒素DON排出体外，减少对细胞的 毒害。3、 利用本专利技术7^,Z^7基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种 启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子。 为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色 变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶 类，也可用无标记选择。转化方法使用小麦中成熟的基因枪法。四附图说明图1 fa户ZM7在经DON诱导的小麦望水白穗部中的克隆注箭头所示从DON诱导的望水白穗组织cDNA中扩增出的ra/Wi7，M表示分子量标记 图2半定量RT-PCR分析fa尸iW7基因在DON诱导的小麦望水白穗部的表达情况 注A表示ra尸Z /i7基因在DON诱导0， 6， 12, 24， 48， 72小时的穗部的表达，B表示内参7i/力uh'/ 基因在D0N诱导0， 6， 12, 24， 48， 72小时的穗部的表达图3 7a尸/M7在中国春缺体-四体和缺失系上的染色体定位 注NT1A/1D表示普通小麦背景中缺失2条1A染色体，添加2条1D染色体， NT1B/1A表示普通小麦背景中缺失2条1B染色体，添加2条1A染色体， 其它号码依此类推NT7D/7A表示普通小麦背景中缺失2条7D染色体，添加2条7A染色体， 箭头所指为7^ZW/在5A中缺失 图4植物表达载体pCAMBIA1301-220. 6的构建模式图图5转基因植株与非转基因植株在含DON的1/2MS培养基上生长30天后情况 注CK为野生型对照，K10为转基因拟南芥阳性株L代五具体实施例方式1、 利用小麦cDNA基因芯片筛选小麦抗赤霉病相关基因小麦(7riWcase"w/历L.)品种望水白(公知公用材料，裴自友，贾高峰 等.普通小麦籽粒D0N含量的配合力分析,作物学报，2007，33(5):731 - 737)在幼 穗期采用单花滴注法接种DON (Sigma公司)水溶液(100ng/ml)，接种12、 24小 时后取样，分别提取RNA (用Invitrogen公司的Trizol试剂提取)等量混合形成 实验组；用水接种作为对照，对照与DON接种的幼穗同时取样，分别提取RNA等量 混合形成对照组。实验组和对照组的R亂样品用Superscript II反转录成cDNA (试 剂盒购自Gibco/BRL， Gaithersburg, MD, USA)，并进一步在体外转录成cRNA。实 验组和对照组的cRNA样品同时与小麦表达谱芯片GeneChip⑧Wheat Genome Array(http:〃www. affymetrix. com/products/arrays/specific/wheat. affx)进行杂 交，芯片杂交实验在"上海国家生物芯片工程中心"完成，实验步骤参照Af fymetrix 公司说明书"Expressed Analysis Technical Manual"(http:〃www. affymetrix. com/support/technical/manual/expression manual. affx)。以实验组信号与对照组信号比值大于2为标准筛选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个ＰＤＲ型的ＡＢＣ转运蛋白基因，来自于小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｓｅｔｉｖｕｍ　Ｌ．）品种望水白，命名为ＴａＰＤＲ１基因，其核苷酸序列为ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘大钧，尚毅，马璐琳，王秀娥，亓增军，曹爱忠，邢莉萍，陈佩度，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]