本发明专利技术公开了一种南美白对虾中副溶血性弧菌分子预测模型的构建方法；所述构建方法包括如下步骤：生鲜南美白对虾的采样和贮藏；生鲜南美白对虾的处理；生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌的活菌定量测定；根据副溶血性弧菌的活菌定量测定值构建一级模型和二级模型；对所述一级模型和二级模型进行验证。本发明专利技术还提供了一种如前述的南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌分子预测微生物模型的构建方法，该构建方法基于分子生物学技术，可用于生鲜南美白对虾中自然存在的副溶血性弧菌行为变化的预测。本发明专利技术填补了虾中副溶血性弧菌的预测微生物模型的空白，可为副溶血性弧菌行为变化的研究及副溶血性弧菌定量微生物风险评估提供有效的数据基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种生鲜南美白对邮中副溶血性弧菌分子预测模型的构建方法及应 用，属于食品微生物学
技术介绍
副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分别于河口和海洋环境中，食用被 该菌污染的水产品，极易导致严重的急性肠胃炎，并伴随有恶屯、、头疼、低烧等症状，该菌引 起的食物中毒在中国已高居微生物性食物中毒的首位。南美白对邮是中国乃至于亚洲地区 最为重要的水产品，同时，因为其味道鲜美、营养丰富，也是运些区域的最受欢迎的食品之 一。然而研究报道邮类在养殖过程中易受副溶血性弧菌的污染，在溫暖季节该菌的自然污 染率可高达100%，对水产品品质和公共卫生造成了极大的安全隐患。 预测食品微生物模型（Predictivefoodmicrobiology)被视为解决食源性致病 菌潜在危害的重要措施之一，通过构建食品中食源性致病菌的预测微生物学模型，可快速 地对食品中致病菌的生长情况进行判断，从而有效地控制食品中病原微生物的风险。描述 不同溫度下邮中副溶血性弧菌预测微生物学模型的已有报道：Boonyawantang等研究了不 同溫度下菌株BCC24339在邮中行为变化，Tang等研究了副溶血性弧菌03:Κ6在即食邮中 的生长动力学特征，王敬敬、马冯莉等研究了 4~3(TC条件下混合菌株在南美白对邮中的 行为变化。然而运些研究均局限于人工接种样品中副溶血性弧菌行为变化的研究，没有研 究真实地反应自然存在于邮中的副溶血性弧菌的生长动力学特征。 构建生邮中自然存在副溶血性弧菌的预测微生物模型的最大难点在于，基于选择 性培养基的传统平板计数方法无法完全排除复杂背景菌群的干扰，从而造成副溶血性弧菌 定量效果的失准。近年来，一些研究报道，实时巧光PCR方法可W用于预测微生物学模型 的构建，并描述食品中致病微生物的行为变化。实时巧光PCR方法的引物和探针具有极高 的特异性，可W在复杂的食品环境中做到精准的定量。然而该方法也有一个巨大的缺陷： 基于DNA的实时巧光PCR方法无法区分样品中的活菌与死菌，基于DNA的检测方法无法区 分样品中的死菌和活菌，从而过高估计了样品中致病菌的数量。叠氮漠化丙锭（Propidium monoazide，PM)是一种对核酸具有高度亲和力的光敏反应染料，能够进入细菌的死细胞 中，选择性地交联死菌的DNA，将其与DNA扩增检测技术相结合，可有效地抑制死菌细胞DNA 的扩增。近年来，利用PMA结合实时巧光PCR技术，已经广泛应用于多种食源性致病菌的活 菌检测，但尚未有研究利用该技术构建预测微生物学模型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种南美白对邮中副溶血性弧菌分子预测模型的构建方 法，W解决现有技术中所存在的上述问题。 为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下： 第一方面，本专利技术提供了一种南美白对邮中自然存在的副溶血性弧菌的分子预测 模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：[000引生鲜南美白对邮的采样和胆藏； 生鲜南美白对邮的处理； 生鲜南美白对邮中副溶血性弧菌的活菌定量测定； 根据副溶血性弧菌的活菌定量测定值构建一级模型和二级模型； 对所述一级模型和二级模型进行验证。 作为优选方案，所述生鲜南美白对邮的采收和胆藏的方法为： 在每年8月份对邮塘中的南美白对邮进行一次采样，共取540只南美白对邮样品， 分为6组，分别置于4°C、7°C、15°C、20°C、25°C、30°C下胆藏，另取18个样品留作副溶血性弧 菌最初污染量的定量分析备用。 作为优选方案，样品从采样到胆藏的时间不超过比。 作为优选方案，所述生鲜南美白对邮的处理的方法包括如下操作： 对不同胆藏溫度的南美白对邮进行取样：4°C条件下胆藏36化，每24h取6只南美 白对邮；7 °C条件下胆藏18化，每1化取6只南美白对邮；15 °C条件下胆藏75h，每化取6只 南美白对邮；20°C条件下胆藏60h，每化取6只南美白对邮；25°C条件下胆藏42h，每化取 6只南美白对邮；30°C条件下胆藏2地，每化取6只南美白对邮； 将上述南美白对邮样品置于含有蛋白腺水溶液的均质袋中均质2min后，收集南 美白对邮液均浆，用于后续的副溶血性弧菌活菌定量分析。 作为优选方案，所述副溶血性弧菌的活菌定量测定的方法包括如下操作：S1、PMA母液的制备：每980 W L (1地2〇中溶解入Im邑PMA，得到的2mM的PMA母液， 于-20°C下避光保存'[002。 S2、PMA前处理：取25μL的PMA溶液加入到975μL南美白对邮液均浆中，获得 25μΜΡΜΑ终浓度的ΡΜΑ-样品混合液；将所述ΡΜΑ-样品混合液置于黑暗条件下处理15min后，利用光解仪处理后，进行离屯、，收集菌体； S3、DNA提取：参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书对所述菌体中的DNA 进行提取，同时对所述说明书中的方法进行了修正，延长了菌体的收集时间至lOmin、溶菌 酶的处理时间为比、蛋白酶K的处理时间为化；[002引 S4、PMA实时巧光PCR活菌定量测定： 选择副溶血性弧菌的t化基因作为PMA实时巧光PCR扩增的祀基因，W对应的 化qMan探针标记FAM作为报告基团，B册1作为泽灭基团，所述扩增所用的引物的序列为， 正向引物：5'-ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA-3 ;反向引物：5'-GATGAGCGGTTGATGTCCAA-3'， TaqMan探针的序列为：5' -FAM-CGCTCGCGTTCACGAAACCGT-B册1-3'；[002引制备PMA实时巧光PCR反应体系20化，其中，各组分分别为aOXPCR Buffer 2 μ L、浓度为50mM的MgS04溶液1. 2 μ L、浓度为lOmM的dNTPs mix溶液0. 5 μ L、浓度为抓/ μ L的化q DM聚合酶0. 2 μ^稀释至终浓度为10 μ Μ的Ξ对引物各0. 5 μ L稀释至终浓度 为10 μ Μ的Ξ根探针各0. 2 μ L、DNA模板1 μ L W及d地2012. 5 μ L ; 进行40个循环的PM实时巧光PCR反应，在每个所述循环中，控制95 °C预变性 2min，95°C变性时间为15s，退火溫度为60°C，退火时间为Imin; 将PMA实时巧光PCR反应输出的CT值与所述南美白对邮的副溶血性弧菌浓度与 CT值关系的标准曲线进行对照，获得对应的南美白对邮中的副溶血性弧菌浓度。[002引标准曲线的构建：称取8份生鲜南美白对邮25g分别放入8只无菌均质袋中，在每 只所述无菌均质袋中加入225mL的蛋白腺水均质2min，获得8份10倍稀释的南美白对邮 液匀浆，在每份南美白对邮液匀浆中加入不同稀释梯度的副溶血性弧菌ATCC33847菌液， W获得携带菌量为102到10SCRJ/g的南美白对邮液匀浆，W获得南美白对邮体内的副溶血 性弧菌的浓度对PMA实时巧光PCR输出结果的关系曲线。采用上述的PMA实时巧光PCR体 系反应，利用菌落计数的结果和PM实时巧光PCR输出的CT值构建反应的标准曲线，并计 算曲线的斜率（slope),利用公式E= 计算多重实时巧光PCR反应的扩增效率。 其结果表明，该PM实时巧光PCR体系具有良好的扩增当前第1页1 2&nbs本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种南美白对虾中副溶血性弧菌的分子预测模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：生鲜南美白对虾的采样和贮藏；生鲜南美白对虾的处理；生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌的活菌定量测定；根据副溶血性弧菌的活菌定量测定值构建一级模型和二级模型；对所述一级模型和二级模型进行验证。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵勇，张昭寰，娄阳，肖莉莉，王旭，潘迎捷，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。