本发明专利技术涉及一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒及其检测方法和应用，包括如下试剂：酶切底物、裂解液以及酶切液。检测方法包括：通过电泳法或细菌克隆形成法测定核酸内切酶MUS81的活性。本发明专利技术检测恶性肿瘤患者外周血中核酸内切酶MUS81的活性，满足临床诊断、治疗监测及预后判断的需求；充分考虑肿瘤患者外周血中MUS81活性改变的特殊性，故针对性强，有较好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于恶性肿瘤检测领域，特别设及一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒及其 检测方法和应用。
技术介绍
近年，由于环境及生活方式的改变，我国恶性肿瘤的发病率显著升高，其中特别是 肺癌、肠癌、卵巢癌等。研究证实，基因组不稳定性对肿瘤的发生发展具有重要作用；核酸内 切酶是在维持基因组完整性中起关键作用的酶，因而其活性的变化与肿瘤的发生、发展密 切有关。 通常将能降解DNA分子的酶，称为核酶，其中分又为两种：能从多核巧酸链的末端 开始水解核酸的酶称为核酸外切酶；而从多核巧酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切 酶（endonuclease,EN)。在核酸水解酶中，EN为水解分子链内部憐酸二醋键生成寡核巧酸 的酶。值得一提的是，人们在研究特异性的限制-修饰现象时，发现了核酸内切酶，该酶可 抵御外源物入侵。一个细胞具有多种不同功能的、有较好活性的核酸内切酶将会保护细胞 不被破环。核酸内切酶是一类广泛存在于细胞内的核酸水解酶，在体内参与宿主防御机制、 肿瘤细胞的形成与发展等有关。 MUS81(methylmethanesulfonate,UVsensitive,geneclone81,对MMS及UV 敏感的81号基因）基因是Int&rthal等利用酵母双杂交技术发现Mol GenGenet，2000,263(5):812-827];其在DM损伤修复W及染色体稳定性维持起作用。敲 除Mus別基因的酵母菌较正常酵母菌对甲横酸盐（MM巧和紫外线0JV)更敏感，故命名为 MUS81。人MUS81，为XPF-ERCC1家族的核酸内切酶，与EME1/EME2(无催化活性、参与维 持复合物的稳定性）相结合形成一种DNA结构特异的限制性内切酶，可W结合DNA、参与 DNA损伤修复及基因组不稳定的调控eMUSSl可修复DNA正常代谢过 程中产生的断裂双链W及暴露于某种化学试剂和放射线产生的断裂双链，是皿修复的关 键组分。MUS81可影响基因组不稳定和皿过程，在体细胞中MUS81突变、缺失或减少增加了 基因组不稳定性。最近研究掲示，MUS81可与其他分子相互作用，例如在DNA损伤的位点，与 RMI/FANCM形成复合物，共同发挥修复作用。MUS81复合物也可与DNA修复分子如RAD52/ RAD54等结合，运些中间产物可显著促进核酸内切酶活性。MUS81在S期及Μ期均参与细胞 周期的调控，从而保证基因组的完整性和稳定性。 研究发现，MUS81与皿异常密切相关，MUS81表达水平下调后，皿活性显著下降。 由于人正常细胞内端粒酶活性被抑制，端粒会随着细胞分裂增加而逐渐缩短，当端粒缩短 到临界长度时，此时的端粒结构易被识别为DNA损伤，从而激活DNA损伤应激通路，细胞衰 老或调亡。Zeng等发现，MUS81可被招募到端粒延长替代机制（Alternativelengthening oftelomere,ALT)细胞的核屯、结构，作用于ALT细胞端粒重组的D-loop结构，从而促进ALT 细胞端粒的同源重组。端粒重复结合因子2(TRF2)可结合于MUS81，从而抑制其核酸内切酶 活性。而且，HR修复核屯、酶MUS81在恶性肿瘤发生、进展中表达异常，会增加HR活性和持 续影响基因表达谱。 对于核酸内切酶活性测定，通过酶切消化DNA，来分析样本中的酶活性，然后电泳 染色呈现大小不一的片段，对运些片段的迁移率及数量进行分析。核酸内切酶的酶切效率 与底物的性质有很大的关系，底物的单双链结构、分子构型、DNA链中酶识别位点的数目W 及位点附近的序列等都影响着酶的催化反应。共价闭合环（超螺旋构型）DNA比其相应的 线性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋构型DNA彻底降解，需要的酶量相对就大。对于DNA 双链的酶切，反应液中盐的浓度至关重要，要确定合适的盐浓度，核酸内切酶对儀离子等的 要求并不严格，5-30mmol/L均可作用。酶切效果主要与酶的活性密切相关，与反应时间也相 关，时间一般不宜超过1.化，酶切的溫度一般控制在37°C。酶切反应可用热（65°C)lOmin、 过量邸ΤΑ或用酪提取来终止。 恶性肿瘤易复发、转移，进展快，预后差。核酸内切酶如MUS81在DNA损伤后参与 修复途径（HR途径），如果其表达异常，会引起肿瘤基因组不稳定加剧、基因重排增加。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒及其检测 方法和应用，该试剂盒检测恶性肿瘤患者外周血中核酸内切酶MUS81的活性，满足临床诊 断、治疗监测及预后判断的需求；充分考虑肿瘤患者外周血中MUS81活性改变的特殊性，故 针对性强，有较好的临床应用前景。 本专利技术的一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒，包括如下试剂：酶切底物、裂解液W 及酶切液。 所述酶切底物为质粒DNA，序列如SEQ ID NO. 1所示。 所述裂解液的组成为：〇.Olmol/L憐酸盐溶液PBS、4-6%CHAI^和0. 1-0. 2U/μ1 RNaseinhibitor;其中，憐酸盐溶液的抑值为7. 4。 所述酶切液的组成为：0.Olmol/L憐酸盐溶液PBS、4-6%CHAPS、0. 1-0. 2υ/μ1 RNaseinhibitor、l-2mmol/LMgClz和 0.1-0. 2mmol/LDTT;其中，憐酸盐溶液的抑值为 7. 4。 本专利技术的一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤： (1)将收集到的恶性肿瘤细胞加入裂解液，裂解细胞60~90min;然后反复吸取混 匀，离屯、吸取上清，-90°C~-70°C冻存；根据裂解的细胞数或者直接测定总蛋白浓度，配制 成混合液； (2)向混合液中加入溶解于酶切液的质粒DNA，在振荡器上溫和振荡，然后离屯、数 秒，37~38°C恒溫水浴中解育30~40min，随后80~90°C水浴作用10~20分钟或用邸TA 终止反应； (3)最后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切底物被切割的程度判断核酸内切酶 MUS81的活性或者进行转化细菌，根据菌落形成能力的强弱判断核酸内切酶MUS81的活性。 所述步骤（3)中的琼脂糖凝胶电泳检测的条件为：20ul混合溶液；1%的琼脂糖凝 胶；电泳时间Ih;稳定电压130V。 本专利技术的一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒的应用，应用于检测恶性淋己瘤、肺 癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌或卵巢癌单个核细胞的核酸内切酶MUS81活性升高。 核酸内切酶MUS81有W下几种基本功能： (1)在肿瘤发生或进展时，该酶的活性可显著升高； (2)恶性肿瘤患者外周血液中该蛋白其可W与恶性肿瘤患者辅助诊断及预后判断 中发生淋己结或远处转移的机体状态密切相关，该酶的活性异常升高； 阳0巧 （3)核酸内切酶活性主要设及MUS81的核酸酶。 本专利技术的特点在于：(A)特异性强，专一反映核酸内切酶的活性；度）结果观察直 观，条带切割后或菌落生长易于计算及比较分析。 有益效果本专利技术检测恶性肿瘤患者外周血中核酸内切酶MUS81的活性，满足临床诊断、治 疗监测及预后判断的需求；充分考虑肿瘤患者外周血中MUS81活性改变的特殊性，故针对 性强，有较好的临床应用前景。【附图说明】 图1为环状双螺旋质粒DNA经切割后的条带；其中，A为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核酸内切酶MUS81检测试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：酶切底物、裂解液以及酶切液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢仁泉，郭林，高翔，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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