本发明专利技术提供一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，包括以下步骤：1)以深海嗜热噬菌体GVE2基因组为模板进行PCR扩增；2)对PCR扩增产物和pET-30a载体进行双酶切反应；3)回收酶切后的PCR产物和pET-30a载体片段后进行连接反应；4)将连接产物转化到感受态细胞中后，挑取克隆，并测序验证；5)将基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达；6)提取并纯化该耐热重组核酸内切酶；7)使用获得的GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA：切割反应温度大于60℃，切割反应pH值大于5.5。该耐热重组核酸内切酶活力高，能够在大于60℃的高温条件下无特异性地切割DNA，在分子生物学、疫苗工业、蛋白和多糖类制药工业等涉及到核酸去除的催化领域有着广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及基因工程技术，具体涉及构建能够过量表达 耐热HNH型核酸内切酶的基因工程菌、并将其应用在高温条件下切割DNA的方法。
技术介绍
核酸酶是一类水解核酸磷酸二酯键的酶，存在几乎在所有的生物体中。核酸酶在 遗传机制的不同方面发挥重要的作用，例如避免突变、DNA修复、DNA复制和重组、为生长代 谢清除核苷和磷酸、宿主防御外源的核酸分子、病毒感染宿主的建立和细胞凋亡等。除此之 外，核酸酶还被广泛应用于分子生物学的各种研究中，例如核酸结构的检测、RNA的快速测 序、蛋白纯化中去除核酸以及抗病毒试剂的应用等。 根据核酸酶作用的方式，核酸酶可以分为核酸内切酶和核酸外切酶。核酸内切酶 从核酸的内部切开核酸，核酸外切酶从核酸的一端逐个切开核酸，作用时产生单核苷酸。此 外，也有少数既作用于链的内部又作用于链的外部的核酸酶，例如小球菌核酸酶。根据核酸 酶作用的底物，核酸酶可以分为RNA酶、DNA酶以及非特异性核酸酶。RNA酶只作用于RNA，DNA 酶只作用于DNA，非特异性核酸酶对RNA、DNA两者均可切割。 HNH(Histine-Asparagine_Histine，组氨酸-天冬酰胺-组氨酸）型核酸内切酶具 有两个高度保守的组氨酸(His)和一个高度保守的天冬酰胺(Asn)的结构域，该保守的结构 域约由35个氨基酸组成，如图1所示。HNH型核酸内切酶包括大肠菌素 E7和E9、S1和S2脓菌素 和一些DNA限制性核酸内切酶，比如Kpnl，PacI和Hpy99I。目前，关于源自于噬菌体HNH型核 酸内切酶的报道，多数是从常温菌中发现。这些源自常温菌的HNH型核酸内切酶只能在常温 条件例下切割DNA，不能在高温条件下发挥切割核酸的功能，使其应用受到了限制。现有技 术中，关于该高温噬菌体HNH型核酸内切酶的表达及应用，尚未有研究和报道。 GVE2(Geobacillus virus E2)是从分离于自东太平洋深海热液区的嗜热菌 Geobacillus sp. 263分离出的一种高温噬菌体。GVE2能够生存在高温环境(例如:生长温度 为60°C，Liu B, Zhang X. Deep-sea thermophilic Geobacillus bacteriophage GVE2transcriptional profile and proteomic characterization of virions.Appl Microbiol Biotechnol .2008 80(4) :697-707)，是一个典型的Siphoviridae·菌体，与入口麓 菌体在形态上极其相似，但其基因组序列和预测的蛋白质序列与λ噬菌体同源性很低。目 前，GVE2基因组的测序已经完成，其编码一种ΗΝΗ型核酸内切酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用基因工程技术构建一株能够过量表达GVE2HNH型核酸内切 酶的基因工程菌，通过诱导表达、热处理和镍离子亲和柱纯化等步骤，制备出可以在温度高 于60°C的条件下高效切割双链DNA的电泳级耐热重组酶蛋白，以便于在高温环境下有效切 害扣NA，可以应用于如分子生物学、疫苗工业、蛋白和多糖类制药工业等涉及到核酸去除的 催化领域。 为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下： 本专利技术提供了一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于， 包括以下步骤： 1)利用具有如下核苷酸序列的扩增引物，以GVE2基因组为模板进行PCR扩增： 正向引物为：5'-GGA ATT CCA TAT GCC AAG CAA ACC ACT GCG ACC-3'， 反向引物为：5'-CCG CTC GAG CCC ΑΤΑ CCG TCG CTT ATC TTC CG-3'； 2)对步骤1)中得到的PCR扩增产物和pET_30a载体进行Ndel和Xhol双酶切反应； 3)回收并纯化步骤2)中所得的酶切后的PCR产物和pET-30a载体片段后，进行酶基 因与载体的连接反应； 4)将步骤3)中所得的连接产物转化到感受态细胞中，随后涂布在含有卡那霉素的 LB平板进行培养后挑取克隆，并提取质粒进行测序验证； 5)将步骤4)中获得的基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表 达； 6)从步骤5)中所获得的细胞中提取并纯化该GVE2HNH型耐热重组核酸内切酶； 7)使用步骤6)中获得的GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA:切割反应温度大于60°C， 切割反应pH值大于5.5。 优选地，步骤7)中所述的切割反应温度为60-70°C。 优选地，步骤7)中所述切割反应pH值为大于7.5。 优选地，步骤7)中所述切割反应中加入Fe2+，Zn2+，Mn 2+，Mg2+，Ca2+，Ni2+或者Co2+，以 不同程度促进该酶切割DNA，其中，Mn 2+是该酶切割反应的最佳金属离子。 优选地，步骤7)中所述切割反应中不使用盐，高盐会抑制该酶切割DNA的能力。 可选地，步骤6)中所述的提取并纯化处理方法为对所述细胞进行超声波破碎、热 处理和镍离子亲和柱纯化。 可选地，步骤7)中使用GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA的反应体系为20yL: 200ng质 粒pET-30a DNA或者XDNA、20mM Tris-HCl pH 8.0、lmM DTT、100nM GVE2HNH型核酸内切酶、 2mM MnCl2、0.1mg/ml BSA和10%甘油;切割反应时间为15分钟。本专利技术达到了如下的有益效果： (1)利用基因工程技术，构建了 一种表达耐热GVE2HNH型核酸内切酶的基因工程 菌，该基因工程菌能够高效的表达GVE2HNH型核酸内切酶，且后续的纯化步骤简单易行，很 容易得到大量的该耐热重组酶蛋白（每升发酵液可得到2mg耐热重组酶蛋白）； (2)该耐热重组核酸内切酶分子量为16 · 78kDa，活力高，具有非特异切害UDNA的能 力，能够在高温条件(大于60 °C )下无特异性地切割DNA，能够作为培养细胞上清和细胞裂解 液去粘度的首选酶制剂，在分子生物学、疫苗工业、蛋白和多糖类制药工业等涉及到核酸去 除的催化领域有着广阔的应用前景。【附图说明】图1是部分HNH型核酸内切酶的氨基酸序列比对。HNH型核酸内切酶源自于高温噬 菌体GVE2和常温菌体：Bacillus phage gamma，Bacillus phage phi 105，Clostridium phage phi3626，Enterobacteria phage HK97。保守的氨基酸残基加粗表示。图2是诱导前、诱导后、超声波破碎细胞、热处理和镍离子亲和纯化等步骤的SDS-PAGE结果图。图3是GVE2HNH型核酸内切酶的质谱分析结果。图4是反应温度对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。图5是GVE2HNH型核酸内切酶热稳定性的电泳凝胶图。图6是酶量对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。图7是反应时间对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。图8是反应pH对GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA影响的电泳凝胶图。 图9是金属离子(Fe2+、Zn2+、Mn2+和Cu2+)对GVE2H本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用耐热重组HNH型核酸内切酶切割DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用具有如下核苷酸序列的扩增引物，以深海嗜热噬菌体GVE2基因组为模板进行PCR扩增：正向引物为：5'‑GGA ATT CCA TAT GCC AAG CAA ACC ACT GCG ACC‑3'，反向引物为：5'‑CCG CTC GAG CCC ATA CCG TCG CTT ATC TTC CG‑3'；2)对步骤1)中得到的PCR扩增产物和pET‑30a载体进行NdeI和XhoI双酶切反应；3)回收并纯化步骤2)中所得的酶切后的PCR产物和pET‑30a载体片段后，进行酶基因与载体的连接反应；4)将步骤3)中所得的连接产物转化到感受态细胞中，随后涂布在含有卡那霉素的LB平板进行培养后挑取克隆，并提取质粒进行测序验证；5)将步骤4)中获得的基因序列正确的克隆质粒转化到感受态细胞中进行诱导表达；6)从步骤5)中所获得的细胞中提取并纯化该耐热重组核酸内切酶；7)使用步骤6)中获得的GVE2HNH型核酸内切酶切割DNA：切割反应温度大于60℃，切割反应pH值大于5.5。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张立奎，黄彦超，杨立翔，徐家俊，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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