用于切除靶核酸的核酸、组合物和方法技术

本申请提供了一种核酸、组合物、和方法，用于切除宿主细胞基因组的一个或多个基因座。特别地，本申请提供了一种可切除的核酸构建体，从5’至3’方向包括：第一串联重复核酸、第一归巢核酸内切酶识别位点、靶核酸、第二归巢核酸内切酶识别位点、和第二串联重复核酸。在某些实施方式中，可切除的核酸构建体整合至宿主基因组中，通过将归巢核酸内切酶识别位点与一种或多种适宜的归巢核酸内切酶接触，可以将靶核酸从宿主细胞基因组中切除。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请提供的核酸、组合物、和方法通常涉及分子生物学和基因工程领域。2.
技术介绍
在很多领域，包括代谢工程、工业微生物学、合成生物学、和基础分子遗传学研究中，都需要利用基因工程技术从宿主细胞基因组或游离基因中切除靶核酸。然而，此前用于除去靶核酸的方法在应用方面受到了约束和限制。例如，利用位点特异性重组酶方法除去会遗留有害的特异性重组酶结合位点，这些位点会在宿主细胞中产生潜在的基因组不稳定性。其他方法产生切除事件的频率较低，因而，有必要找到一些方法，通过生长选择经历切除事件的稀有宿主细胞。需要提供一种核酸、组合物、和方法，用于从宿主细胞基因组或游离基因中高频率和高精确度地切除靶核酸，而不会产生潜在的基因组不稳定性。3.专利技术概述本申请提供了一种核酸、组合物、和方法，用于切除宿主细胞基因组的一个或多个基因座。第一方面，本申请提供了一种可切除的核酸构建体，从5’至3’方向包括:a)第一串联重复核酸，b)第一归巢核酸内切酶识别位点，c)靶核酸，d)第二归巢核酸内切酶识别位点以及e)第二串联重复核酸。在某些实施方式中，可切除的核酸构建体整合至宿主细胞基因组中。在某些实施方式中，第二归巢核酸内切酶识别位点是可选的。第一和第二归巢核酸内切酶识别位点用于归巢核酸内切酶剪切可切除的核酸构建体。归巢核酸内切酶与归巢核酸内切酶识别位点结合能够剪切位于或邻近归巢核酸内切酶识别位点的可切除的核酸构建体。在某些实施方式中，每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点独立地包含14-40个核苷酸碱基对。在某些实施方式中，每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点独立地由14-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由20-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由25-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由30-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由35-40个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个归巢核酸内切酶识别位点独立地由24个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，第一或第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个是选自下组的归巢核酸内切酶的识别位点:LAGLIDADG (SEQ ID NO:1)归巢核酸内切酶、HNH归巢核酸内切酶、His-Cys盒归巢核酸内切酶、GIY-YIG (SEQ ID NO:2)归巢核酸内切酶、和蓝藻归巢核酸内切酶。在某些实施方式中，每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点独立地选自下组的归巢核酸内切酶的识别位点:laglidadg (seq id no:1)归巢核酸内切酶、hnh归巢核酸内切酶、His-Cys盒 归巢核酸内切酶、GIY-YIG (SEQ ID NO:2)归巢核酸内切酶、和蓝藻归巢核酸内切酶。在某些实施方式中，第一或第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个是选自下组的归巢核酸内切酶的识别位点:1-CreI, 1-MsoI, 1-SceI, 1-SceIV, H-DreI, 1-HmuI,1-PpoI, 1-DirI, 1-NjaI, 1-NanI, 1-NitI, 1-TevI, 1-TevII, 1-TevIII, F-TevI, F-TevII,F-Cph1、P1-Mga1、1-Csm1、1-CeuI^P P1-SceI。在一些实施方式中，每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点独立地选自下组的归巢核酸内切酶的识别位点:1-CreI, 1-MsoI, 1-SceI, Ι-SceIV、H-Dre1、1-HmuI, 1-PpoI,1-Dir1、1-Nja1、1-Nan1、1-Nit1、1-Tev1、1-TevI1、1-TevII1、F-Tev1、F-TevI1、F-Cph1、P1-MgaI, 1-CsmI, 1-Ceu1、和Pl-Scel。在特定实施方式中，第一或第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个是1-SceI识别位点。在特定实施方式中，第一或第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个是F-CphI识别位点。靶核酸裂解后，可以通过第一和第二串联重复促进染色体内重组来修复宿主细胞的基因组。在某些实施方式中，每个第一和第二串联重复核酸独立地包含至少18个核苷酸碱基对。在某些实施方式中，每个第一和第二串联重复核酸独立地由18至500个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，每个第一和第二串联重复核酸独立地由18至200个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，宿主细胞是酵母细胞，并且每个第一和第二串联重复核酸独立地由18至200个核苷酸碱基对组成。在某些实施方式中，靶核酸编码选择性标记。在某些实施方式中，选择性标记选自下组:URA3、潮霉素B磷酸转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、博来霉素抗性基因和草胺膦N-乙酰转移酶。在某些实施方式中，上文所述的可切除的核酸构建体进一步包括连接至所述第一串联重复5’端的第一基因组整合位点，以及连接至所述第二串联重复3’端的第二基因组整合位点。有利地，第 一和第二基因组整合位点可以促进可切除的核酸构建体整合至宿主细胞基因组。在另一个方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包括上文所述的可切除的核酸构建体。在某些实施方式中，可切除的核酸构建体进一步包括连接至所述第一串联重复5’端的第一整合位点，以及连接至所述第二串联重复3’端的第二整合位点。在某些实施方式中，宿主细胞是原核细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是真核细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是单细胞真核生物体。在某些实施方式中，宿主细胞是酵母细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是单倍体酵母细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是二倍体酵母细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是酿酒酵母菌株的酵母细胞。在某些实施方式中，宿主细胞进一步包括载体，其包含编码归巢核酸内切酶的归巢核酸内切酶核酸，其中所述归巢核酸内切酶能够在第一和第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个位点处或其附近结合及剪切。在一些实施方式中，载体包含编码归巢核酸内切酶的归巢核酸内切酶核酸，所述归巢核酸内切酶能够在每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点的位点处或其附近结合及剪切。在某些实施方式中，载体包含启动子元件，其控制编码归巢核酸内切酶的归巢核酸内切酶核酸的表达。某些实施方式中，启动子元件是诱导型启动子。在某些实施方式中，启动子元件是组成型启动子。在另一个方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含上文所述的整合至宿主细胞基因组的可切除的核酸构建体。在一些实施方式中，可切除的核酸构建体从5’至3’方向包括:a)第一串联重复核酸，b)第一归巢核酸内切酶识别位点，c)靶核酸，d)第二归巢核酸内切酶识别位点以及e)第二串联重复核酸。在某些实施方式中，宿主细胞进一步包括载体，其包含编码归巢核酸内切酶的归巢核酸内切酶核酸，所述归巢核酸内切酶能够在第一或第二归巢核酸内切酶识别位点中的至少一个位点处或其附近结合及剪切。在某些实施方式中，归巢核酸内切酶核酸编码归巢核酸内切酶，所述归巢核酸内切酶能够在每个第一和第二归巢核酸内切酶识别位点处或其附近结合及剪切。在某些实施方式中，归巢核酸内切酶是1-SceI。在某些实施方式中，归巢核酸内切酶是F-CphI。在另一个方面，本申请提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯尔斯顿·R·本杰明，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，
类型：
国别省市：