一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法技术

一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法，属于生物工程技术领域。用SOE-PCR的方法扩增得到短肽的全长基因；将若干短肽的基因定向串联起来；将得到的串联基因构建到酵母菌的表达载体中，进而转化酵母菌；诱导表达串联多肽并切割成目的短肽。本发明专利技术的特点是可以通过该方法用酵母菌高效表达多种小分子短肽，这些短肽有重要应用价值；此外，利用串联短肽质粒的高效表达，产品开发成本极低。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种通过构建短肽串联体酵母表达质粒制备活性小肽的方法，其步骤如下：(1)将短肽序列D的前半部分命名为D1，在其5“端依次加入修饰基因T1、G1，得到上游引物：T1及其保护碱基—G1—D1；然后，将D1序列后端的5～10个碱基和短肽序列D的后半部分合起来命名为D2，其互补序列为D2“，在3’端依次加入修饰基因G2、T2的互补序列G2“、T2“，得到下游引物：D2“—G2“—T2“及其保护碱基互补序列；用SOE?PCR的方法得到经过修饰的单个短肽序列，其序列构成如下：T1及其保护碱基—G1—D—G2—T2及其保护碱基其中，T1、T2为限制性内切酶的酶切位点，并且T1、T2互为同尾酶；G1、G2为蛋白切割位点，D为短肽序列；(2)选择质粒X，其含有一对同尾酶T1、T2酶切位点且同时含有酵母表达质粒中也有的酶切位点R，将质粒X用T1、T2进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带；将上述回收的经过双酶切的质粒X的长片段和步骤(1)得到的经过修饰的单个短肽序列及限制性内切酶T1、限制性内切酶T2、T4连接酶组成混合体系，先在37℃温度条件下双酶切1h～2h，接着将混合体系在16℃温度条件下连接1h～2h；循环该过程数次后，65℃终止反应，醇沉，重悬得到含有不同倍数短肽串联体的重组质粒X；得到的重组质粒上不仅有短肽串联体，而且串联体序列之后有酶切位点R，这样我们就为短肽串联体引入了酶切位点R；(3)将构建好的重组质粒X转化到质粒克隆菌株中，小量提取质粒，双酶切并测序鉴定，保存含有所需串联体个数的菌种，并提取含所需倍数的短肽串联体的质粒以进行表达质粒的构建；(4)将步骤(3)得到的含所需串联体个数的重组质粒和酵母表达质粒分别用限制性内切酶T1、限制性内切酶R进行双酶切反应，琼脂糖电泳，分别回收重组质粒经过双酶切得到的串联体片段及空酵母表达质粒经过双酶切得到的长片段；(5)将回收的串联体片段和酵母表达质粒长片段加入到含有T4连接酶的连接体系，在T4连接酶适宜的温度条件连接12h～16h，经琼脂糖凝胶电 泳、胶回收得到含有所需倍数短肽串联体的表达质粒；(6)将得到的酵母表达质粒转化到质粒克隆菌株中，小量提取质粒，双酶切鉴定；(7)将经过鉴定、构建好的酵母表达质粒转化进酵母菌GS115中，进行100％甲醇诱导表达；(8)取诱导表达后的菌液，离心2～3min，分别收集上清液和沉淀，之后将含有串联短肽的上清液或沉淀选择合适的方法进行纯化，最后用G1和G2蛋白切割位点所对应的蛋白酶或化学试剂切割将串联短肽切割为目的短肽，从而制备得到活性小肽。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：施维，赵昊，张桂荣，李全顺，于洋，林雪贞，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：