一种促进植酸酶在毕赤酵母中表达的载体制造技术

本发明专利技术为一种促进植酸酶在毕赤酵母中表达的载体，属于微生物工程技术领域，具体涉及一种含有翻译调控因子Hac1的载体。在表达植酸酶的毕赤酵母工程菌中导入上述载体后，工程菌的植酸酶表达水平得到显著提高。毕赤酵母表达工程菌具有胞外分泌和和翻译后修饰的优点，因此，超水平表达毕赤酵母工程菌可应用于工业化生产，节省发酵成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物工程
，具体涉及ー种含翻译调控因子Hacl的表达载体及含有该载体的毕赤酵母工程菌。
技术介绍
蛋白质的异源表达是常用分子生物学领域研究的重点之一；特别是对于エ业化生产而言，超水平表达是提高生产效率和节省成本的关键手段之一。蛋白质异源表达的宿主很多，有原核微生物，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等；也有真核微生物，如毕赤酵母和里氏木霉等。原核生物具有代时短，生长快的优点；但是去缺乏胞内翻译后修饰系统。因此，原核生物的异源表达蛋白往往没有活性，或者说表达水平很低(张小霞等，2004，国外医学卫生学分册)。而真核微生物具有翻译后修饰系统，同时往往又具有分泌表达和高密度发酵的优势；因此，越来越多的真核微生物被开发来应用于生产エ业酶和食品酶等。无论是学术研究还是规模化工业生产，毕赤酵母(Pichia pastoris)是最常用的真核表达系统之一(Porro等,2005, Mol.Biotechnol.)。但是，毕赤酵母的蛋白质表达水平非常低，多数工程菌胞外分泌的目的蛋白含量约为 8g/L (Niebaur 等，2005, Protein expression technologies)。有很多因素影响蛋白质表达水平，如启动子，拷贝数，信号肽、密码偏爱性，翻译修饰和发酵エ艺等(Payne等2008, Appl.Environ.Microbiol.)。但是,研究发现毕赤酵母胞内的很多促进蛋白质折叠，囊泡运输和跨膜运输的因子能显著提高蛋白质的表达水平。只有正确折叠的蛋白质才能运输到胞外。如果外源蛋白翻译后不能正确折叠，贝U会引起蛋白非正确反应，简称UPR反应(unfolded protein response,简称UPR)。UPR会抑制转录和反应；同时促进错误折叠蛋白质的降解，从而影响蛋白质表达水平(Alimjan,2010，Appl Microbiol BiotechnoD0 UPR反应能调控胞内很多与蛋白表达相关因子的表达，如分子伴侶，折叠酶、囊泡运输相关的激酶和转录因子HaclP等(Mouna,2010,Microbial Cell Factories ),其中 HaclP 能促进蛋白质表达(Saloheimo, 2003，Mol.Microbiol)。HaclP的表达是受到UPR严格调控的。Hacl_mRNA是组成型表达的，但是其内部含有I个内含子；只有内含子被剪切后，Hacl-mRNA才能正确表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种含翻译调控因子Hacl的表达载体，并通过将该表达载体导入产外源植酸酶的毕赤酵母工程菌，构建得到新的工程菌。所述工程菌中外源植酸酶的表达水平得到了显著提高，具有广泛的应用前景。本专利技术一方面提供一种用于表达翻译调控因子Hacl基因的真核表达载体。上述翻译调控因子Hacl基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。上述翻译调控因子Hacl基因编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:3。 上述表达载体为毕赤酵母表达质粒pGAPZ。本专利技术还提供一种提高植酸酶在毕赤酵母工程菌中表达的方法，是将上述的表达载体转入表达植酸酶的毕赤酵母工程菌中，形成新的重组工程菌。上述的重组工程菌为毕赤酵母SDLH-1 (Pichia pastoris SDLH-1),已于2012年12月5日保藏于位于武汉珞珈山武汉大学的“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCCN0:M 2012503。本专利技术还提供了上述毕赤酵母工程菌SDLH-1的应用，用于高效表达外源植酸酶。本专利技术构建了一个表达翻译调控因子Hacl基因的表达载体，同时将该载体导入产植酸酶的毕赤酵母工程菌，得到新的工程菌。该工程菌表达植酸酶的水平得到显著提高，表达量提高17%以上。附图说明图1:本专利技术构建的用于表达翻译调控因子Hacl基因的真核表达载体的质粒遗传图谱。具体实施例方式以下实施例是为了更好地说明阐述本
技术实现思路
，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1: Hacl基因的克隆1.1总DNA的提取将毕赤酵母过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min,弃上清；加入 400ii I 抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS) ; 95°C加热5min，然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后，加入200 u I IOM NH4AC,冰浴IOmin ；13000rpm离心lOmin，取上清;加入2倍体积的无水こ醇，-20°C放置30min ； 13000 rpm离心lOmin，弃上清；用70%こ醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20°C保存。1.2基因克隆采用融合PCR方法克隆基因，相应的Taq酶购自TaKaRa公司。在GenBank上查询获得了毕赤酵母的Hacl核酸序列SEQ ID NO:1。本实验设计了 3条PCR引物，分别命名为F-Hacl-EcoRl，R-Hacl-Notl和R-Hacl-N (引物具体序列见表I)，来扩展去内含子的Hacl成熟型mRNA的DNA序列。表I引物具体序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组表达载体，所述的载体为用于表达翻译调控因子Hac1基因的真核表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体，所述的载体为用于表达翻译调控因子Hacl基因的真核表达载体。2.按权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于所述的翻译调控因子Hacl基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。3.按权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于所述的翻译调控因子Hacl基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。4.按权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄亦钧，程斯达，康丽华，王华明，许丽红，刘艳萍，吴秀秀，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：